蛋白酶體抑制劑DCI對胃癌細胞增殖的影響

1、蛋白酶體抑制劑DCI對胃癌細胞增殖的影響    【摘要】  目的:探討蛋白酶體抑制劑3，4二氯異香豆素(DCI )對人胃癌細胞系BGC823體外增殖和凋亡的影響。方法:將DCI加入BGC823胃癌細胞,采用MTT法檢測細胞的生長抑制效應(yīng),Annexin /PI法及電鏡觀察DCI對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果:DCI可明顯抑制BGC823細胞體外增殖,隨著DIC濃度的增加和處理時間的延長,細胞凋亡率增加; 流式細胞術(shù)顯示DCI可誘導(dǎo)胃癌細胞早期凋亡，細胞被阻滯在G1期；電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)DCI處理后的部分細胞具有凋亡細胞的典型形態(tài)特征。結(jié)論:DCI可抑

2、制人胃癌BGC823細胞增殖并促進其凋亡。 【關(guān)鍵詞】  蛋白酶體抑制劑;胃癌;細胞凋亡；細胞增殖泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome pathway，UPP）是生物體內(nèi)進行蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一,包括細胞周期調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄激活和抑制因子、腫瘤抑制因子等12。蛋白酶體抑制劑能阻斷UPP,抑制多種腫瘤的生長，目前該類藥物硼替佐米已進入臨床，MG132也在肝癌、直腸癌、肺癌等多系腫瘤細胞中得到廣泛研究35。3，4二氯異香豆素(3，4dichloroisocoumarin,DCI )同樣具有抑制蛋白酶體的功能，對腫瘤細胞也有抑制作用，本研究觀察其對胃癌細胞生長

3、增殖的影響。1  材料與方法1.1  材料1.2  方法1.3  統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用x-±s表示，應(yīng)用SPSS 10.0軟件Probit(概率單位法)計算，并行線性回歸分析。2  結(jié)果2.1  DCI對胃癌細胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，100800mol·L-1的DCI對胃癌細胞均有抑制作用，見表1,12、24 h 的IC50 分別為478和398mol·L1。24 h回歸方程為Y=-000104X±0.91476,其中Y、X 分別為細胞率和DCI的濃度。Y和X的相關(guān)系數(shù)r為0.98,P&l

4、t;0.01。表1  MTT法檢測DCI對胃癌細胞增殖的影響（略）2.2  DCI對BGC823細胞周期分布和凋亡率的影響DCI作用于BGC823細胞24 h后收集細胞,用流式細胞術(shù)檢測細胞周期,各個周期細胞百分比改變見圖1。150和300mol·L1 濃度的DCI處理BGC823細胞,G0/G1期細胞增加,而G2和S/M期細胞明顯減少（表2）。圖2表示DCI作用24h后細胞的凋亡率。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，正常培養(yǎng)的BGC823細胞凋亡率為2.54%，而經(jīng)150mol·L1DCI作用后,凋亡率已達18.27%,G1期前出現(xiàn)凋亡峰，DCI濃度為300mol&#

5、183;L-1時,細胞凋亡率達23.86%,顯示DCI誘導(dǎo)的BGC823細胞凋亡具有量效關(guān)系。2.3  透射電鏡觀察結(jié)果對照組細胞體積大,細胞器豐富,染色質(zhì)均勻(圖3A)。經(jīng)DCI作用后部分BGC823細胞出現(xiàn)細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征:細胞體積縮小,胞漿濃縮,細胞器減少,出現(xiàn)空泡，染色質(zhì)固縮、邊緣化,并形成凋亡小體(圖3B)。3  討論蛋白酶體抑制劑可有效地誘導(dǎo)惡性、增殖程度高的細胞凋亡,對正常細胞幾乎無作用,從而成為治療腫瘤的新途徑6。DCI最初是作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，隨后有多項研究顯示DCI對UPP有明顯抑制作用。早老素可以誘導(dǎo)Alzheimer病發(fā)生，其降解主要依靠

6、蛋白酶體系統(tǒng)降解，蛋白酶體抑制MG132可以抑制早老素的降解，DCI也可以抑制其降解，但效率較MG132低，而同樣作為廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑的AEBSF對早老素降解無作用7。DCI還可抑制泛素化的生長相關(guān)蛋白GAP43降解，主要是作用于20S蛋白酶體亞單位N末端蘇氨酸殘基，抑制蛋白酶體的糜蛋白酶、胰蛋白酶樣活性作用89。A.對照組； B.BGC823細胞經(jīng)150mol·L1 DCI作用24 h組； C.BGC823細胞經(jīng)300mol·L1 DCI作用24 h組圖1  DCI作用于BGC823細胞后細胞DNA周期分布的改變（略）表2  DCI作用于胃癌細胞

7、24h各周期細胞所占比例 （略）Drexler報道DCI在50mol·L-1濃度時即可引起HL60細胞凋亡，對凋亡DNA片段的分析顯示，DCI作用較硼替佐米強10。另有文獻報道DCI可以使絲氨酸蛋白酶水平較高的纖維母細胞瘤L929細胞凋亡，凋亡與DCI和絲氨酸蛋白酶作用?；闹虚g產(chǎn)物有關(guān)11。而DCI作為蛋白酶體抑制劑對其它實體瘤作用的研究，國內(nèi)外鮮有報道。本試驗將DCI作用于胃癌細胞后,細胞增殖明顯受抑制,且呈劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系,其中劑量關(guān)系較顯著,r達0.98。當(dāng)DCI濃度小于100 mol·L-1時,細胞生存率減少不明顯,400 mol·L-1的DCI作用于細胞后,細胞凋亡率隨時間延長逐漸增加。流式細胞術(shù)檢測顯示DCI可誘導(dǎo)腫瘤細胞早期凋亡,電鏡也觀察到典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,表明DCI可以有效地促進胃癌BGC823細胞發(fā)生凋亡,細胞被大量阻滯在G1期，S期和G2/M期細胞明顯減少,這些可能是DCI抑制BGC823細胞增殖的機制之一。