抗生素最低抑菌濃度

1、抗生素最低抑菌濃度（MIC）和半數(shù)抑菌濃度（MIC）測定方法幾種測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）方法：1.1.常量肉湯稀釋法1.1.1.抗菌藥物貯存液制備 抗菌藥物貯存液濃度不應(yīng)低于1000g/ml(如1280g/ml)或10倍于最高測定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低于上述濃度?？咕幬镏苯淤徸詮S商或相關(guān)機構(gòu)。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。例如：需配制100 ml濃度為1280g/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750g/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據(jù)公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750g/ml）/1

2、280g/ml=107.0ml，然后將182.6 mg抗生素粉劑溶解于107.0ml稀釋劑中。制備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配制好的抗菌藥物貯存液應(yīng)貯存于-60以下環(huán)境，保存期不超過6個月。1.1.2.藥敏試驗用抗菌藥物濃度范圍 根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。1.1.3. 培養(yǎng)基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.27.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時，應(yīng)在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按制造廠家的要求配制需要量的MH肉湯。嗜血桿

3、菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%5%溶解馬血的MH肉湯。1.1.4.接種物的制備 有2種方法配制接種物，一是細菌生長方法，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3-5個，接種于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35孵育2-6h。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含12×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配制法，對某些苛養(yǎng)菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養(yǎng)1824h的菌落調(diào)配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進行1100稀釋后備用。注意應(yīng)在15分鐘內(nèi)接種完配制好

4、的接種物，并取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養(yǎng)，以檢查接種物純度。1.1.5.稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其余每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1280g/ml） 0.4ml混勻，然后吸取1ml至第2管，混勻后再吸取1ml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后在每管內(nèi)加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約

5、為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125g/ml。1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35普通空氣孵箱中孵育1620h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育2024h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古霉素腸球菌應(yīng)持續(xù)孵育滿24h。1.1.7.結(jié)果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應(yīng)檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應(yīng)檢查接種物的傳代培養(yǎng)情況以確定其是否污染，質(zhì)控菌株的MIC值是否處于質(zhì)控范圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。甲氧芐胺嘧啶或磺

6、胺藥物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長管藥物濃度為受試菌MIC。根據(jù)NCCLS推薦的分界點值標準，判斷耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌癥除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內(nèi)或血液中所達到的濃度所抑制，或?qū)儆诰哂刑囟退帣C理（如-內(nèi)酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低于敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如-內(nèi)酰胺類藥物）被抑制，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑

7、制。另外，中介還作為“緩沖域”，以防止由微小的技術(shù)因素失控，所導(dǎo)致較大的錯誤解釋。1.2.微量肉湯稀釋法 1.2.1.抗菌藥物和培養(yǎng)基制備 同常量肉湯稀釋法。1.2.2.MIC板制備 無菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10l，第12孔不加藥作為生長對照，冰凍干燥后密封，-20以下保存?zhèn)溆谩?.2.3.接種物制備 將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經(jīng)MH肉湯11000稀釋后，向每孔中加100l，密封后置35普通空氣孵箱中，孵育1620h判斷結(jié)果。當試驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時，孵育時間為2024

8、h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗時孵育時間必須滿24h。此時，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125g/ml。1.2.4.結(jié)果判斷 以在小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內(nèi)細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時，應(yīng)記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報告結(jié)果，需重復(fù)試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結(jié)果相同或低一個稀釋度（1孔或2倍）。2.瓊脂稀釋法 瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌藥物，加入

9、融化并冷至50左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板，接種受試菌，孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。本法優(yōu)點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結(jié)果可靠，易發(fā)現(xiàn)污染菌；缺點是制備含藥瓊脂平板費時費力。2.1.培養(yǎng)基制備 使用MH瓊脂，按商品說明書進行配制，pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎(chǔ)加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺藥時，使用溶解的馬血）。2.2.含藥瓊脂平板制備 根據(jù)實驗設(shè)計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解，并在4550水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌

10、平皿，瓊脂厚度34mm。通常按19比例配制藥物瓊脂平板，根據(jù)需要來選擇藥物濃度范圍。配制好的含藥瓊脂平板應(yīng)裝入密封塑料袋中，置28冰箱可貯存5天。2.3.接種物制備與接種 制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，再110稀釋，以多點接種器吸取制備好菌液（約12l）接種于瓊脂平板表面，每點菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為58mm的菌斑。接種好后置35孵育1620h（甲氧西林耐藥葡萄球菌、萬古霉素耐藥腸球菌孵育時間應(yīng)滿24h），觀察結(jié)果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。2.4.結(jié)果判斷 將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的最低藥物濃

11、度為MIC。在含甲氧芐胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細菌生長的最低藥物濃度作為終點濃度。如果出現(xiàn)有2個以上菌落生長于含藥濃度高于終點水平的瓊脂平板上，或低濃度藥物瓊脂平板上不長而高濃度藥物瓊脂平板上生長現(xiàn)象，則應(yīng)檢查培養(yǎng)物純度或重復(fù)試驗。3.E試驗（E-test） E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗，其原理基本同擴散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴散，在試條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，同時還彌補了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。3.1.培養(yǎng)基、菌液制備和接種 同紙片擴散法。3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法，E試驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂后不得再移動。直徑150mm的平皿內(nèi)可放置6根E試驗試條，90mm者一般只能放置1根。3.3.孵育時間和溫度 同紙片擴散法。3.4.結(jié)果閱讀 孵育后圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數(shù)刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC。閱讀時應(yīng)注意的問題見供應(yīng)商的產(chǎn)品說明書。主要有三種:稀釋法,紙片擴散法.E-test 法稀釋法就