細胞思考題2015粗制版

1、定量檢測幾十萬個分散的細胞的DNA含量應(yīng)用流式細胞檢測技術(shù)（FCM）1.收集單細胞懸液(1 106個)，緩慢加入1 ml預(yù)冷的70乙醇，于4固定過夜，或-20長期固定。2離心收集細胞，再以1ml PBS徹底洗去乙醇；3去上清后加入染色液(包含50ug/ml PI，100ug/ml RNase A，0.2% Triton X-100)，37 染色30min后上機檢測。4DNA熒光染料能與DNA結(jié)合，DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強度反應(yīng)了DNA吸收熒光分子的多少。通過流式檢測就能反映細胞內(nèi)DNA的含量?？淳€粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)以及此處的某種蛋白顆粒看線粒體內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)及蛋白顆粒要用透射電

2、鏡。定量檢測一批光鏡切片上含有某種蛋白質(zhì)的細胞的數(shù)目首先對切片上的全部細胞進行針對目的蛋白的熒光探針特異性標記（熒光染色，熒光標記抗體，外源導(dǎo)入熒光蛋白），同時對細胞行核復(fù)染。再以熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。熒光探針的特異性標記：即熒光強度與特異性標記蛋白的表達量成正相關(guān)了解細胞發(fā)生死亡時的形態(tài)學(xué)和某個酶的改變首選以流式細胞術(shù)通過對檢測細胞以Annexin V/PI雙染法或亞二倍體(Sub-G1)峰的檢測分選出凋亡細胞。再熒光標記凋亡細胞的要檢查的酶，以激光掃描共聚焦顯微鏡觀察酶的變化。對細胞電子染色后以掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。了解某個新基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能1.首選以North

3、ern blot檢測該蛋白在各組織中的表達。選出表達豐度最高組織細胞。2設(shè)立該組織細胞的cDNA文庫，從中篩選出與該蛋白有相互作用的蛋白（編碼基因）。3.以酵母雙雜交法及GSTpulldown方法對所篩選蛋白做驗證。4.由所篩選出的蛋白功能來分析推測該蛋白功能并用分子生化技術(shù)及細胞生化技術(shù)檢測。透射電子 當樣品厚度小于100nm時，部分電子可穿透樣品，將穿透樣品的電子叫做透射電子，利用透射電子信息成像的電子顯微鏡稱為透射電鏡。二次電子 在入射電子的轟擊下，樣品表面550nm深度激發(fā)出來的電子稱為二次電子，利用二次電子信息成像的電子顯微鏡稱為掃描電鏡。電子顯微鏡：電子顯微鏡鏡以電子射線作為照明源

4、，以電磁場作為透鏡，具有高分辨率和放大倍率的顯微鏡。電鏡用于研究組織和細胞的超微結(jié)構(gòu)。分辨率 表示人眼和光學(xué)儀器能夠辨別兩點之間最小距離的標志。免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是將免疫學(xué)方法與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，利用抗原與抗體特異結(jié)合的特性，在超微結(jié)構(gòu)水平定位特異大分子的技術(shù)。如果需要了解細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化，請問應(yīng)選擇哪種類型的電鏡？TEM透射電鏡樣本取材時必須做到快、小、輕、冷，為什么？快：1分鐘內(nèi)固定，盡可能保持其生活狀態(tài)，因為瞬間的拖延都會導(dǎo)致細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 ?。?約1mm的小塊，組織塊過大其中央得不到及時固定會發(fā)生細胞自溶現(xiàn)象。輕： 不要牽拉、鋸、擠壓組織，避免細胞受到損傷。冷：

5、 低溫操作，4保存，降低酶的活性，避免組織發(fā)生自溶。沒有及時固定的組織細胞透射電鏡下會出現(xiàn)何種改變？ 自溶掃描電鏡取材必須注意哪些？因為掃描電鏡觀察的是樣品表面結(jié)構(gòu)，必須充分暴露并保護好觀察面，避免損傷要觀察的部位，材料要新鮮，取材部位要準確，樣品塊要盡量小一些，用鋒利的刀片，盡快固定。氣管、胃、腸粘膜可固定在濾紙上展平，要將表面的血液、粘液用生理鹽水或緩沖液仔細漂洗干凈。貼壁細胞: 進口玻璃蓋玻片1cm1cm ，生長細胞，緩沖液漂洗，戊二醛固定12小時游離細胞： 玻璃蓋玻片表面涂10%多聚賴氨酸（10分 鐘），未完全干燥時涂一層細胞（10分鐘），戊二醛固定12小時簡述激光共聚焦顯微鏡的工作原

6、理。在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源、掃描裝置、共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的新型熒光顯微鏡系統(tǒng)。以激光作為激發(fā)光源，對樣本進行斷層掃描，同時采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術(shù)，最終獲得高分辨率光學(xué)切片圖像的熒光顯微鏡系統(tǒng)。簡述激光共焦顯微鏡與熒光顯微鏡的差別。它有哪些優(yōu)缺點？光源不同（激光Vs普通光），掃描方式不同（斷層掃描VS一次成像），聚焦不同（光源針孔+檢測針孔雙聚焦VS透鏡聚焦），圖像采集處理不同（計算機采集處理VS目視）優(yōu)點：高水平及垂直分辨率，可經(jīng)計算機處理成三維結(jié)構(gòu)，缺點：1.逐點掃描，成像速度慢。2.觀測厚度：50-100m3.分辨率極限：0.15m簡述激光共聚焦顯微鏡的功能。觀察

7、標記熒光素的樣品：1.薄層斷層掃描2.多通道同時成像3.ZOOM成像4.多維度成像5.熒光定量分析負顯性突變：對影響蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵位點進行突變，所得突變體不僅喪失了原有功能，并且可以抑制內(nèi)源性蛋白質(zhì)的功能。DNA microarray：是一種用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高通量技術(shù). 它由一系列成千上萬個精微的DNA寡核苷酸點排列而成，這些DNA寡核苷酸含有百億分之一摩爾特定序列的。它們或者是一小截基因，或者是DNA的其他成分。它們被作為探針，在非常嚴格的條件下和一個叫做靶分子的cDNA 或 cRNA樣本雜交。由于靶分子帶有熒光標記，因此通過探針-靶分子的雜交，并根據(jù)雜交后熒光的有或無 ，強或弱

8、，對靶分子中特定核酸序列的豐度進行檢測。共激活因子：是一種蛋白，本身不能與DNA結(jié)合，但能夠通過與具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的激活因子（或轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合來增強基因的表達。共激活因子可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的許多其他過程，如轉(zhuǎn)錄的延長、終止、 RNA剪接以及激活因子和共激活因子復(fù)合體的降解等。報告基因: 是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控。 si RNA(small interfering RNA)：也被稱為短干擾RNA

9、(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，通常為人工合成的長約20到25個核苷酸的雙股RNA，利用其可與特定信使RNA（mRNA）發(fā)生同源性結(jié)合并使之降解的特點，誘導(dǎo)序列特異的目標基因發(fā)生沉默，從而阻斷特定基因的表達。具有靶向、高效、易于操作的特點，是一種研究細胞內(nèi)基因表達的新技術(shù)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）: 研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，

10、從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA）:是一種研究核酸結(jié)合蛋白和其相關(guān)的核酸結(jié)合序列相互作用的技術(shù)。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-蛋白復(fù)合物或RNA-蛋白復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或單鏈。檢測可用純化蛋白、部分純化蛋白或核細胞抽提液。研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的活動情況需要從哪些方面入手？由以下幾個方面決定：合成速率：mRNA 水平。 穩(wěn)

11、定性：蛋白水平。定位：細胞核、細胞質(zhì)、細胞器?；钚裕好富钚裕杭っ?、NADPH氧化酶、組蛋白脫乙酰酶（HDAC）等轉(zhuǎn)錄活性：主要指轉(zhuǎn)錄因子(TF)，促進靶基因轉(zhuǎn)錄的活性（注意：轉(zhuǎn)錄因子活性受到co-activator或co-repressor的調(diào)節(jié)）和哪些蛋白在一起相互作用、相互影響？通常有哪些實驗手段可以用來研究蛋白和DNA的相互作用？體內(nèi) ：染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）。體外：凝膠電泳遷移率改變分析（EMSA）可用哪些技術(shù)對細胞內(nèi)某個蛋白的水平進行干預(yù)? 它們有什么區(qū)別?增減合成該蛋白的必需氨基酸，促進或抑制編碼該蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄SiRNA對編碼該蛋白的RNA沉默。免疫細胞化學(xué)技術(shù)：是利用

12、免疫化學(xué)反應(yīng)來定位組織細胞中特異大分子的一類技術(shù)。原位雜交技術(shù)：將分子生物學(xué)與細胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位，與細胞內(nèi)需探測的核酸雜交以檢測特異核酸分子的技術(shù)，可以反映特異核酸分子的量，同時也可以反映與組織、細胞、細胞器或染色體結(jié)構(gòu)的位置關(guān)系。第二抗體：能夠識別一抗的種屬特異性，并因此結(jié)合一抗，稱為二抗（抗種屬抗體）原位雜交技術(shù)嚴格度：也叫嚴緊度。決定探針是否與含不相配堿基的核酸序列結(jié)合的條件，是決定雜交雙鏈間形成氫鍵穩(wěn)定性的條件，從而最終影響特異性。簡述免疫熒光技術(shù)和免疫親和技術(shù)的比較。免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下

13、可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位。親和細胞化學(xué)技術(shù)是利用親和物質(zhì)之間高度親和能力而互相結(jié)合，以定位特異分子的技術(shù)。（親和物質(zhì) 具有多價能力的物質(zhì)，與另一種親和物質(zhì)有高度親和力，又能與抗體、蛋白質(zhì)及各種標記物(熒光素、酶、膠體金等)結(jié)合）親和技術(shù)優(yōu)點：靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好。根據(jù)標記物的不同可用熒光顯微鏡，光鏡，電鏡等多種觀察方法.如何在培養(yǎng)細胞水平或臨床標本上了解新發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定位？如需了解蛋白質(zhì)定位和定量的信息，可綜合采用哪些技術(shù)？（分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)）免疫組織化學(xué)，免疫細胞化學(xué)，免疫熒光技術(shù)，免疫膠體金技術(shù)，免疫酶技術(shù)，免疫親和技術(shù)以免疫酶技術(shù)為例，簡述操作流程。（“流程”的意思）.

14、 免疫酶技術(shù)是將酶作為標記物將組織細胞中形成的抗原抗體復(fù)合物得到標記，再通過酶細胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顯微鏡下可見的顯色物質(zhì)，間接顯示抗原物質(zhì)的定位。流程：組織細胞固定石蠟包埋或冷凍切片（保持原位）-化學(xué)反應(yīng)顯色反應(yīng)觀察如何應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分析2種蛋白質(zhì)的共定位，簡述原理和操作流程。免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位。基本過程：固定（組織脫水，包埋、切片）-免疫細胞化學(xué)反應(yīng)，抗原與抗體標記系統(tǒng)反應(yīng)。原位雜交技術(shù)中如何應(yīng)用了其他幾種細胞化學(xué)技術(shù)？基本實驗過程：使含有特異序列、經(jīng)過標記的核酸單鏈即探針，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸

15、單鏈即靶核酸發(fā)生雜交,再以放射自顯影或免疫細胞化學(xué)方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。探針標記純化(變性) 涂覆乳膠 放射自顯影 原位雜交雜交體探測：加酶聯(lián)抗體加酶底物顯色 金銀染色 樣品制備切片通透處理1） 同位素標記探針放射自顯影2） 加入底物四唑氮藍和吲哚酚酶細胞化學(xué)技術(shù)3） 核酸探針雜交分子生物學(xué)技術(shù)4） 地高辛抗體與探針結(jié)合免疫細胞化學(xué)技術(shù)為什么說原位雜交技術(shù)是分子生物學(xué)和細胞化學(xué)技術(shù)的結(jié)合？原位雜交技術(shù)中，先將標記的核酸探針與組織細胞中靶核酸分子結(jié)合形成雜交體，這是分子生物學(xué)技術(shù)，然后用同位素或免疫細胞化學(xué)技術(shù)探測雜交體。如 用地高辛標記核酸探針，雜

16、交后用堿性磷酸酶聯(lián)結(jié)的小鼠抗地高辛抗體與探針結(jié)合，這里應(yīng)用的是免疫細胞化學(xué)技術(shù)。為了使酶可見，再加入其底物四唑氮藍和吲哚酚，最終形成藍紫色物質(zhì)，這就是酶細胞化學(xué)技術(shù)。這樣，通過酶細胞化學(xué)最終產(chǎn)生藍紫色物質(zhì)，間接探測了酶的定位，又通過酶聯(lián)抗體與探針的免疫組化反應(yīng)，間接探測了探針，進而間接探測了靶核酸的定位。流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞（或生物學(xué)顆粒）的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。一般可分為三個部分：1.細胞流動室及其液流驅(qū)動系統(tǒng)2.激發(fā)光源及其光束形成系統(tǒng)3.細胞信號檢測與分析、顯示、記錄系統(tǒng)。散射光信號：前向散射光FSC：細胞前向小角度

17、散射光信號，反映被測細胞的體積大小和活力?？捎靡栽O(shè)閾排除樣品中的細胞碎片，設(shè)門排除細胸團塊。側(cè)向散射光SSC：細胞90度側(cè)向散射光信號，信號強度反映細胞內(nèi)部顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化。實際工作中常用于外周血樣品區(qū)分中性粒細胞與其他白細胞。層流：當液體在管道中穩(wěn)定流動時是以管道的軸心為中心分層流動的，中心軸處液流速度最快，從中心軸向外流速逐層減低。根據(jù)柏努利定律液流速度大的地方壓強低，液流速度小的地方壓強高，所以層流能保證樣品中的每一細胞都沿流動室的中心軸運動。鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù)，可以實現(xiàn)兩種液體的同軸流動，樣本細胞流位于軸心穩(wěn)定流動，外面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦

18、：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后，有一個聚焦收縮作用，細胞流直徑被約束在10-20um，避免了多個細胞重疊進入檢測區(qū)。細胞自發(fā)熒光。細胞內(nèi)物質(zhì)自身也發(fā)出熒光，能被FCM靈敏的檢測到，這種未染色的細胞自身發(fā)出的一些熒光稱為自發(fā)熒光。熒光光譜重疊現(xiàn)象：當細胞攜帶兩種以上熒光素激發(fā)出不同波長熒光時，理論上可選擇濾光片使每種熒光僅被相應(yīng)的通道檢測到。但由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射的峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現(xiàn)象就是光譜重疊熒光補償：目前使用的熒光素都是寬發(fā)射譜的，相互之間有明顯的重疊部分。利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除，這種技術(shù)稱為熒光補償。新鮮實體組織的單細胞懸液樣本制備：酶消化法、機械法、化學(xué)試劑處理法三種方法比較：機械法往往造成嚴重的細胞損傷，而結(jié)果卻是較低的細胞產(chǎn)量。酶消化法、化學(xué)試劑處理法對實體組織的分散效果較理想，但會造成所測化學(xué)成分的不良影響。石臘包埋組織單細胞制備：切片-脫脂-水化-消化-終止消化-過濾-收集-70%酒精固定。FCM測量數(shù)據(jù)的存貯、顯示和分析存貯：List Mode方式，用表格的方式將每一個被測細胞的眾多原始測量數(shù)據(jù)全部記錄下來，成為