纖溶酶的研究進(jìn)展

1、纖溶酶的研究進(jìn)展李慧慧20090801118（徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院， 徐州 江蘇 221000,China）摘要： 溶栓療法是血栓性疾病安全有效的治療手段, 開發(fā)安全高效、廉價(jià)的新型纖溶酶對于預(yù)防與治療血栓性疾病具有重要意義。目前, 利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶制成新型的溶栓藥物已成為研究熱點(diǎn)。本文綜述微生物發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的研究背景、現(xiàn)狀、意義及主要方向 。 關(guān)鍵詞：微生物，纖溶酶，藥理作用Fibrinolytic enzyme researchLi Huihui 20,090,801,118(Xuzhou Engineering Food (Biological) Engineer

2、ing, Xuzhou, Jiangsu 221 000, China)Abstract: Thrombolytic therapy of thrombotic diseases is safe and effective treatment, the development of safe and efficient, cheap new plasminogen has important significance for the prevention and treatment of thrombotic diseases. At present, the plasminogen use

3、of microbial fermentation to produce a new thrombolytic agents has become a hot topic. This paper reviews the microbial fibrinolytic enzyme produced by the research background, current status, significance, and the main direction.Keywords: microorganisms, plasminogen, and pharmacological effects血栓栓塞

4、性疾病是一類嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病1, 發(fā)病率呈上升趨勢。目前治療血栓栓塞性疾病的最為有效并且可靠的手段是采用纖維蛋白溶解酶或激活劑進(jìn)行的溶栓療法。溶栓藥物或通過激活纖維蛋白溶解酶原轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶解酶, 后者催化血栓的主要基質(zhì)纖維蛋白水解, 使血栓溶解, 血管再通達(dá)到溶栓的目的; 或者直接溶解血栓中的纖維蛋白, 使血栓溶解。第一代 溶栓劑鏈激酶( SK)和尿激酶( UK)缺乏纖維蛋白選擇性, 不僅能激活血栓表面的纖溶酶原,也能激活血漿中游離的纖溶酶原, 使得纖維蛋白原降解, 會產(chǎn)生全身性出血的副作用。而且SK具有免疫原性會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。第二代溶栓劑組織型纖溶酶原激活劑( tPA)和尿激

5、酶原( proUK)等較第一代溶栓劑對纖維蛋白親和有所提高, 但半衰期短、用藥劑量大、價(jià)格昂貴, 且口服仍會引起內(nèi)出血的副作用目前, 國際上正致力于開發(fā)第三代溶栓劑, 如用蛋白質(zhì)工程手段對tPA進(jìn)行改造, 通過對某些定點(diǎn)突變或是通過相關(guān)結(jié)構(gòu)域的刪除、增加或融合等手段以提高其對纖維蛋白的選擇性、提高對纖溶酶原激活劑抑制劑的抗性、延長其在血液循環(huán)中的半壽期以及發(fā)展導(dǎo)向性溶栓功能。早期研究和發(fā)現(xiàn)的鏈激酶與葡激酶, 已通過臨床試驗(yàn)用于血栓性疾病,其效果穩(wěn)定可靠; 前期深入研究的芽孢桿菌及鏈霉菌來源的纖溶酶, 其理化性質(zhì)與酶學(xué)活性都已被研究清楚, 其中多種纖溶酶已被嘗試用于制備新型溶栓藥; 近期發(fā)現(xiàn)的糞

6、鏈球菌、海洋假單胞菌、白色假絲酵母菌、鐮孢菌、米曲霉菌、藤黃微球菌、黃綠蜜環(huán)菌等等, 所產(chǎn)生的纖溶酶也為新型溶栓藥的開發(fā)提供了更多的可用之材。從不同微生物中提取和純化的纖溶酶, 其理化性質(zhì)和生物學(xué)活性均存在一定差異。筆者著重就這些方面的研究進(jìn)展作一綜述。 1 產(chǎn)酶菌種的篩選與研究 微生物是溶栓藥物的重要來源,現(xiàn)已成功篩選到許多產(chǎn)生纖溶活性物質(zhì)的菌株, 如芽孢桿菌（Bacillussp.) CK11- 4等均能產(chǎn)生纖溶酶。1.1 從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離產(chǎn)纖溶酶菌種 納豆是日本的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品。研究者發(fā)現(xiàn), 這些發(fā)酵食品具有產(chǎn)纖溶活性物質(zhì)的微生物, 它們主要是芽孢桿菌類微生物, 而納豆正是由枯草桿

7、菌(Bacillus subtilis)或納豆桿菌(Bacillus natto)發(fā)酵大豆制成的。1987年, 日本學(xué)者Sumi2等首先在納豆中發(fā)現(xiàn)和提取出具有溶解血栓功能的活性物質(zhì), 并定名為納豆激酶( Nattokinase, NK)，通過納豆激酶的動物體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)以及健康人群的體內(nèi)溶栓實(shí)驗(yàn)研究表明, 納豆激酶除了具有顯著的溶栓作用之外, 還具有溶解纖溶酶原激活劑抑制物的作用, 從而促進(jìn)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生纖溶酶原激活劑, 保證了纖溶酶原激活劑的生理活性 3豆豉是我國傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品,在中醫(yī)藥學(xué)上是一味中藥。李江偉等4首次從豆豉中篩選到產(chǎn)纖溶酶的菌株并分離出豆豉纖溶酶,分離獲得的纖溶酶經(jīng)SDS

8、-PAGE測定分子量為36kDa, 這種纖溶酶可以直接溶解纖維蛋白和人凝血塊。之后,又有學(xué)者相繼報(bào)道了豆豉中存在一種溶解纖維蛋白的酶,此酶具有很好的抗凝、溶栓作用,故命名為豆豉纖溶酶( DEF ) 5,也有人稱溶栓酶、豆豉激酶。 董明盛6等人從豆豉等材料中分離到產(chǎn)纖溶酶的菌種NK-5,經(jīng)確定與納豆菌同為芽抱桿菌屬枯草桿菌群,在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落灰白色,表面粗糙有皺折,邊緣規(guī) 則,無光澤,不透明,在肉湯中生長不混濁,表面形成菌膜,厭氧不生長,為革蘭氏陽性菌,根據(jù)產(chǎn)酶特性初步認(rèn)定為納豆桿菌群。韓潤林7等人從一種豆豉中分離得到一株枯草桿菌(HL-986),有較高的纖溶酶活性,分子量為27kDa。值得

9、一提的是,豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌并非一種,來源不同的菌種在特性上有一定差異,有的菌種可以認(rèn)為與納豆桿菌同屬一個菌群,變異較小,但有的則不能認(rèn)為是同一菌群。豆豉纖溶酶產(chǎn)生菌并非一種,來源不同的菌種在特性上有一定差異,有的菌種可以認(rèn)為與納豆桿菌同屬一個菌群,變異較小,但有的則不能認(rèn)為是同一菌群。1.2 從真菌中分離出的纖溶酶1.2.1 根酶發(fā)酵物中分離出纖溶酶根酶12#纖溶酶的分子量是目前已知纖溶酶中最低的，僅有18KD。 杜連祥等8用華根霉(Rhizopuschiensis)12與去皮的大豆和面粉以一定比例發(fā)酵的方法提出纖溶酶。根霉纖溶酶僅作用于枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶的底物, 而不作用于凝血酶、尿激

10、酶和胰蛋白酶的特異性合成底物, 底物專一性好。能降解纖維蛋白原、鏈, 還可激活血纖維蛋白溶酶原成纖溶酶,從而間接降解纖維蛋白。根霉纖溶酶N端氨基酸序列與其它生物來源的纖溶酶氨基酸序列比較, 沒有同源性。采用凝膠層析和SDS-PAGE法測定纖溶酶分子量分別為16. 6kDa和18. 0kDa, 因此認(rèn)為是一種單亞基的纖溶酶。根霉纖溶酶分子量小, 較大分子量的蛋白質(zhì)更能抵抗胃腸道中酸堿和酶的降解, 因此適合開發(fā)成口服類溶栓劑。 1.2.2 黃綠蜜環(huán)菌發(fā)酵物中分離出纖溶酶 目前，對于真菌類蜜環(huán)菌 產(chǎn)纖溶酶的報(bào)道很少。徐德欽等9以微生物產(chǎn)纖溶酶為指標(biāo)，以真菌為試驗(yàn)菌種，從實(shí)驗(yàn)室保藏的30余株菌種中篩選

11、到1株產(chǎn)胞外溶纖酶較高的菌種 黃綠蜜環(huán)菌U-11, 并對培養(yǎng)基的碳源氮源豆汁加入與否培養(yǎng)基PH，離子及其濃度為指標(biāo)，對該菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶優(yōu)化。研究結(jié)果表明，以麩皮為碳源，酵母膏為氮源，加入 0.1MgSO2，用豆汁配制培養(yǎng)基，PH4.0時(shí) 均可得到單因素試驗(yàn)條件下的最大產(chǎn)酶效果。 1.2.3 蛹蟲草菌絲發(fā)酵產(chǎn)生的纖溶酶 蛹蟲草10內(nèi)含有蟲草素、蟲草酸、多糖、腺苷等多種有效成分，其食用及藥用價(jià)值可與天然冬蟲夏草相媲美11。蛹蟲草（Cordyceps militaries）纖溶酶分子量也較高，為52KD。宿紅艷12等采用鹽析、透析和離子交換層析獲得了蛹蟲草纖溶酶粗酶樣品，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初

12、步研究。蛹蟲草纖溶酶的最適作用溫度為37，最適作用pH值為8.0，與正常人體內(nèi)部血液的生理?xiàng)l件相近有利于以蛹蟲草為原料開發(fā)人體保健營養(yǎng)品和溶纖藥物產(chǎn)品。在此條件下具有最高活性。該實(shí)驗(yàn)也證實(shí)蛹蟲草纖溶酶是一種金屬蛋白酶，金屬離子Ca2+、Fe2+在低濃度(0.01mmol/L)時(shí)蛹蟲草纖溶酶酶活較高。1.2.4 平菇深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶 沈明花13發(fā)現(xiàn)平菇菌絲體產(chǎn)纖溶酶，通過乙醇沉淀, CM-cellulose陽離子交換層析，DEAE-sephadex A-50陰離子交換層析，Sephadex G-75凝膠層析及Superdex75 凝膠層析等步驟將之分離純化。錢朋智等14平菇液體發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶的條件

13、進(jìn)行了優(yōu)化，以平菇為產(chǎn)纖溶酶菌種，采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定該菌株產(chǎn)纖溶酶的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖2，豆?jié){15，KH2PO40.3，Mg2SO40.15最適培養(yǎng)條件為：初始PH為自然，接種量為直徑 1cm的菌片1片，培養(yǎng)基裝80mL液量 ，培養(yǎng)溫度25，搖床轉(zhuǎn)速150r/min ，發(fā)酵周期6d 。在此條件下，發(fā)酵液纖溶酶活力（相當(dāng)于尿激酶活力單位) 穩(wěn)定達(dá)到5.20IU/mL。1.2.5 白靈側(cè)耳纖溶酶 白靈側(cè)耳15 Pleurotus nebrodensis (Inzenga) Quél.，俗名白靈菇，屬于真菌門Eumycota。白靈側(cè)耳具有防治老年人心血管疾病、婦科腫痛、兒童佝僂病及

14、防癌抗癌等藥用功效16。白靈側(cè)耳子實(shí)體浸提液經(jīng)過硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析、凝膠過濾層析和羥基磷灰石色譜柱層析后，純化得到一種纖溶酶17。該酶在SDS-PAGE 中顯單條帶，其分子量約為 30kDa 。該酶在 45以下，pH6.510.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適 pH為8.0，最適溫度為 25。金屬離子 K+對該酶有明顯的激活作用，Zn+、Mg2+、Cu2+對酶有部分抑制作用。金屬離子鰲合劑EDTA 和絲氨酸蛋白酶抑制劑 PMSF 不抑制該酶活性，初步說明此酶既不是金屬酶，也不是絲氨酸類蛋白酶。該酶既具有纖溶酶作用，又具有激活纖溶酶原的作用。此外, 已

15、有從白色假絲酵母菌18、 米曲霉菌19、藤黃微球菌20、密環(huán)菌發(fā)21酵物中分離出纖溶酶的報(bào)道。 2 微生物纖溶酶的藥理作用和應(yīng)用前景微生物纖溶酶有兩類不同的作用機(jī)制：一類是通過激活纖維蛋白溶酶原成為纖溶酶間接降解纖維蛋白，如鏈激酶 葡激酶和BK等，為纖溶酶原激活劑；另一類則可直接降解纖維蛋白溶解血栓 這一類纖溶酶的種類較多，有SW-1DFEQKTPase以及Jeot-Gal 酶等有的纖溶酶兼具直接降解和激活纖溶酶原的雙重作用，CK根霉12#纖溶酶和Bacillus.spnov.SK006等纖溶酶屬于此類型。另外，還有些纖溶酶有2種以上的作用方式，如納豆激酶有直接降解纖維蛋白 激活尿激酶原刺激組

16、織型纖溶酶原激活劑tPA 的產(chǎn)生降解和失活纖溶酶原激活劑tPA的抑制劑PAI-1四種；TPase在直接溶解纖維蛋白的同時(shí)也能夠降解PAI-1使其失活從而發(fā)揮作用22。從溶栓效能來看，TPase 可能成為目前最有前景的溶栓藥物之一。Kim23等比較了TPaseNK以及IMR-NK1對枯草桿菌蛋白酶底物（N-SucAla-Ala-Pro-Phe-pNA）作用的動力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)TPase 催化底物的效率是NK的三倍。由于TPase 也同為枯草桿菌蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，該底物特異性也反映其具有極強(qiáng)的溶解纖維蛋白能力。目前我們提及的這些纖溶酶中，有較多動物及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的僅為納豆激酶（NK）研究發(fā)現(xiàn)其溶

17、栓活性在血液中能維持3小時(shí)以上24。Sumi25等人給肺血栓模型鼠口服納豆菌粉（natto Bacillus），在50mg/Kg 劑量下鼠的肺血栓數(shù)量減少，血清中優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間（ELT）有縮短的趨勢，健康人口服100mg/Kg 劑量1-4小時(shí)后tPA 活性增強(qiáng)，ELT也明顯縮短26，說明服用納豆菌粉也有利于溶栓作用的加強(qiáng)此外，枯草激酶CK目前也已在動物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出比較理想的溶栓效果除溶栓外，一些纖溶酶也發(fā)現(xiàn)具有其他的藥理作用如海洋假單胞菌堿性蛋白酶MPAP能明顯抑制血小板的聚集，對于抑制血栓的形成十分有利27；Ace02對齲齒的主要致病菌變異鏈球菌Streptoccus mutans有溶菌活

18、性28；myulchi 激酶有抑制腫瘤的作用，在6g/mL濃度條件下即能殺傷腫瘤細(xì)胞K562和YAC-1，效果分別達(dá)到35和70，而對人正常胸腺上皮細(xì)胞MCF 10A 活力沒有影響29。納豆激酶還具有誘導(dǎo)玻璃體后脫離的作用，在治療眼部疾病方面也可能發(fā)揮作用30；同時(shí),H su等研究發(fā)現(xiàn)，納豆激酶也能夠降解淀粉樣纖維31 ，有在預(yù)防和治療老年癡呆癥Alzheimer's diease）方面發(fā)揮作用的潛力。動物試驗(yàn)結(jié)果和口服給藥方式研究顯示納豆激酶是一種有潛力的纖溶酶，納豆激酶的片劑沖劑膠囊口服液及針劑已有研究并形成專利32，市場上也有納豆膠囊納豆激酶腸溶膠囊納豆激酶素等保健品銷售，但納豆

19、激酶在人體中的使用效果安全性等數(shù)據(jù)依然相當(dāng)有限或缺乏，其他微生物纖溶酶在溶栓作用專一性體外體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)等方面更亟待進(jìn)一步的研究。1 桂清. 血栓性疾病已成為威脅人類健康和生命的重要疾病 J. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 8( 27): 487.2 SmiH,HamadaH,TsushimaH,eta.lAnovel fibrinolyticenzyme( nattokinase)in thevegetable cheese natto, a typical and popular soybean food in the Japanese diet. Experienti3 馬子川

20、,張英鋒,范林. 溶栓新藥 納豆激酶 J. 化學(xué)世界, 2009( 2): 126-1284 李江偉, 冉國俠, 陳新梅. 豆豉纖溶酶的分離純化及其體外溶栓作用. 中國生化藥物雜志, 1999, 3: 148-1505 閻家麒, 童巖, 減瑩安. 豉纖溶酶的純化及其性質(zhì)研究 J . 藥物生物技術(shù), 2000, 7 ( 3 ) : 149-152.6 董明盛, 江曉. 胞外纖溶酶產(chǎn)生菌的篩選及其產(chǎn)酶條件研究 J .食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27 ( 1 ) : 23-26.7 韓潤林, 張小勇, 張建安, 等. 枯草桿菌溶栓酶的分離純化研究. 中國生化藥物雜志, 2000, 21: 219-

21、2268 杜連祥, 劉曉蘭, 路福平, 等. 根霉12發(fā)酵產(chǎn)生纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì). 生物工程學(xué)報(bào), 2005, 21: 323-3279 徐德欽， 陳海燕， 章海鋒，等. 黃綠蜜環(huán)菌產(chǎn)纖溶酶的發(fā)酵條件優(yōu)化研究J.中國食品學(xué)報(bào)，2009,6（9）:96-103 10 邵力平, 沈瑞祥, 張素軒, 等. 真菌分類學(xué)M. 北京: 中國林業(yè)出版社,1984:109.11 王建芳, 楊春清. 蛹蟲草有效成分及藥理作用研究進(jìn)展J. 中藥研究進(jìn)展, 2005, 22 (5): 30-32.12 宿紅艷， 劉金星，王磊, 等. 蛹蟲草纖溶酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究J.生物工程.食品科學(xué)，2009,21:221-224

22、13 沈明花. 榆干離褶傘溶栓酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究J. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2007 ，33（8）:45-4714 錢朋智， 劉曉蘭， 金卓. 平菇深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的條件研究J. 農(nóng)產(chǎn)品加工., 2010, 2 : 31-3515 戴玉成，周麗偉，楊祝良，文華安，圖力古爾，李泰輝，中國食用菌名錄. 菌物學(xué)報(bào)，2010, 29(1): 1-21 16 甘勇，呂作舟，2001. 阿魏蘑多糖理化性質(zhì)及免疫活性研究. 菌物系統(tǒng)，20(2): 228-232 17 鞠秀云， 曹成亮 ， 蔣繼宏* . 白靈側(cè)耳纖溶酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)分析J. 菌物學(xué)報(bào),2010, 29(3): 403-408 18 肖璐,張仁懷, 張義