RAPD標(biāo)記和基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

1、RAPD標(biāo)記和基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用吳蘇亞（南京中醫(yī)藥大學(xué)，08藥學(xué)一班，042008118）摘要：當(dāng)今，以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)正以其巨大的活力推動著生命各學(xué)科的發(fā)展。近年來分子生物學(xué)理論和技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中也發(fā)揮著重要作用。本文從RAPD標(biāo)記技術(shù)和基因芯片技術(shù)兩個方面探討如何將這一新興技術(shù)結(jié)合到古老的中醫(yī)藥的研究中去，為中醫(yī)藥客觀化、定量化、標(biāo)準化研究提供便利。關(guān)鍵詞:RAPA標(biāo)記；基因芯片；中醫(yī)藥RAPD markers and gene chip technology in the field of application ofTraditiona

2、l Chinese MedicineWu SuyaAbstract: Today, the basis of molecular biology to genetic engineering biotechnology is dominated by its huge energy to promote the development of various disciplines of life.In recent years, theory and techniques of molecular biology research in the field of Chinese medicin

3、e also plays an important role. In this paper, RAPD markers and gene chip technology are two aspects of how this emerging technology into the ancient Chinese medicine to the study, a Chinese medicine objective, quantitative, standardized research facilities.Key words: RAPA marker; gene chip; traditi

4、onal Chinese medicine分子生物學(xué)是從分子水平來研究生命現(xiàn)象的一門基礎(chǔ)學(xué)科。20世紀40年代由W.Astbury首先提出分子生物學(xué)一詞,50年代J.D.Watson和F.Crick關(guān)于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn),60年J.Monod和F.Jacob有關(guān)基因調(diào)控的操縱子學(xué)說的提出,以及70年代初期DNA限制性內(nèi)切酶的問世和DNA體外重組技術(shù)的形成,推動了分子生物學(xué)的飛速發(fā)展。隨著科學(xué)的不斷發(fā)展,分子生物學(xué)與中醫(yī)藥領(lǐng)域互相滲透越來越深入。目前,多種分子生物學(xué)技術(shù)已被引進中醫(yī)藥研究領(lǐng)域,例如核酸探針和分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、雜交瘤和單克隆抗體技術(shù)、基因工程和轉(zhuǎn)基因動植物技

5、術(shù)等。其中RAPD標(biāo)記技術(shù)和基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究中取得不少成就。1、 RAPA標(biāo)記技術(shù)1.1 RAPA標(biāo)記技術(shù)的基本原理RAPD技術(shù)是建立在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10 bp)作為引物,對所研究的基因組DNA進行單引物擴增。模板DNA經(jīng)9094變性解鏈后在較低溫度(3637)下退火,這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對,在72下,通過鏈延伸,形成雙鏈結(jié)構(gòu),完成DNA合成。重復(fù)上述過程,即可產(chǎn)生片段大小不等的擴增產(chǎn)物,通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶,從中篩選出特征性條帶。擴增產(chǎn)物片段的多態(tài)性反映了基因組DN

6、A的多態(tài)性。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生相對分子質(zhì)量的改變。因此,通過對PCR產(chǎn)物的檢測即可測出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。1.2RAPD標(biāo)記技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用1） 種屬分類及親緣關(guān)系的鑒別在藥材的種屬分類及親緣關(guān)系上，因遺傳背景復(fù)雜，親緣關(guān)系不清，傳統(tǒng)的分類方法不能提供種類的遺傳信息，學(xué)者們一直以來存在著分歧，而RAPD標(biāo)記技術(shù)對解決這些分歧點提供了可靠的方法。比如，運用RAPD技術(shù)刻劃了國產(chǎn)姜黃屬(Curcuma)藥用植物的遺傳背景差異，并結(jié)合經(jīng)典分類和異地栽培觀察和聚類分析，初

7、步澄清了姜黃屬植物的一些分類學(xué)爭議，從DNA分子水平上為姜黃屬植物分類與中藥鑒定提供了參考依據(jù)。2） 藥材道地性研究中藥十分講究道地性,道地藥材是傳統(tǒng)公認來源于特定產(chǎn)區(qū)的名優(yōu)正品藥材。道地藥材從生物學(xué)內(nèi)涵講是居群,其一個重要特征是遺傳特征,應(yīng)看成是一個具有共同基因庫的由交配和親緣關(guān)系聯(lián)系起來的同一物種的個體群,因此DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以用于道地藥材的鑒別和道地性的研究。3） 藥材真?zhèn)蔚蔫b定中藥的傳統(tǒng)鑒定是利用植物或動物形態(tài)分類學(xué)和解剖學(xué)特征,從基原、性狀、顯微特征、理化等方面進行藥材鑒別。大部分經(jīng)藥材加工、炮制等處理后,往往失去了原來的形態(tài)和解剖特征,甚至顯微特征也會發(fā)生改變,從而使藥材的真?zhèn)?/p>

8、優(yōu)劣難以鑒別。如對冬蟲夏草及其偽品的鑒定,人參與假人參的鑒定,對射干及混淆品共5種原植物的鑒別等,都取得了比較理想的結(jié)果。1.3發(fā)展前景RAPD技術(shù)目前主要應(yīng)用在中藥領(lǐng)域的種屬親緣關(guān)系、道地性、真?zhèn)舞b定，但是尚缺少鑒別中藥材正品的技術(shù)標(biāo)準。另外，因其操作步驟稍顯復(fù)雜，需要專業(yè)技術(shù)人員，推廣應(yīng)用到生產(chǎn)實際，成本高，不容易為企業(yè)所接受。但隨著RAPD技術(shù)的發(fā)展，設(shè)計出高度特異性引物和開發(fā)出相應(yīng)的檢測試劑盒，使得該項技術(shù)使用更方便、經(jīng)濟、快捷。同時也可以根據(jù)RAPD的分析結(jié)果，模擬出質(zhì)優(yōu)高產(chǎn)的道地藥材內(nèi)、外形成機制及其生長形成條件，培育出更多優(yōu)質(zhì)的中藥材，并可尋找出珍稀、瀕危動植物藥材的替代品，從根

9、本上解決中藥資源的匱乏。2、 基因芯片技術(shù)2.1基因芯片技術(shù)的基本原理基因芯片(gene chip)又稱DNA微陣列(DNAmicroarray),在20世紀90年代初由美國Affymetrix公司的Fodors等提出并開始研究,是在芯片片基上按照特定的排列方式,固定上大量DNA探針,形成一種DNA微陣列?；蛐酒夹g(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段。它將大量的基因探針有序地、高密度地排列在一塊12cm2大小的玻片或膠片上,形成可與目的分子相互作用的固相表面,然后與標(biāo)記的樣品進行雜交,通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。它與其他分析基因表達譜的技術(shù),如RNA

10、印跡(Northern blot)、cDNA文庫序列測定、基因表達序列分析等的不同之處在于,基因芯片可以在一次試驗中同時平行分析成千上萬個基因。2.2基因芯片技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用1) 中醫(yī)研究隨著基因芯片技術(shù)的日益成熟，運用大規(guī)模、高通量的基因芯片技術(shù)，對足夠數(shù)量的同一證型患者的基因表達進行定量分析，建立辨證要素的基因表達譜數(shù)據(jù)庫，再相互組合便可建立證型基因表達譜數(shù)據(jù)庫，以此可作為辨證的客觀規(guī)范化標(biāo)準，因此基因芯片技術(shù)片為中醫(yī)的客觀化、微觀化研究提供了思路與方法，有望成為中醫(yī)現(xiàn)代化的有效手段。在針灸經(jīng)絡(luò)研究方面，針灸由于其為傳統(tǒng)方法無法了解不同系統(tǒng)間動態(tài)作用,針灸的研究總是難以深入發(fā)展。采用

11、基因芯片技術(shù)進行針灸的研究成為發(fā)展趨勢。通過基因芯片技術(shù),建立不同針灸條件下的基因表達譜,分析其中表達差異的基因,進一步通過這些差異基因的功能分析,可以了解不同針灸條件作用下的基因組背景資料;進而了解針灸的可能作用,優(yōu)化臨床針灸療法的參數(shù)選擇,提高針灸臨床療效?；蛐酒€有助于揭示針灸的作用機制。引入基因芯片,可以高通量地檢測細胞內(nèi)基因表達的時空特征,有助于了解針灸促進基因表達的特點;進而再利用蛋白組學(xué)、生物信息學(xué)分析技術(shù),有望揭示針灸作用機制。2) 中藥研究由于中藥成分非常復(fù)雜，單純應(yīng)用傳統(tǒng)的藥物研究方法，很難從整體上其對進行研究。通過基因芯片在同一實驗條件下，一次性檢驗上萬個生物信息的改變

12、，為多靶點藥物作用機制的研究提供了有效的工具。中藥主要是通過調(diào)節(jié)機體的整體功能，即通過對基因的表達調(diào)控而起作用的。利用基因表達譜芯片對比研究某種中藥或其提取物作用于動物前后特定細胞中相關(guān)功能基因表達mRNA水平的異常變化，可提示該中藥在研究劑量下是否有細胞毒性及產(chǎn)生毒性作用的機制。2.3發(fā)展前景基因芯片技術(shù)發(fā)展到今天不過短短十幾年時間,雖然還存在一些技術(shù)難點,但其在基因表達譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領(lǐng)域已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的更加完善,基因芯片在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域一定會發(fā)揮出其非凡的作用,尤其是有效中藥、中藥有效成分的篩選,新發(fā)現(xiàn)中藥的功能鑒定,經(jīng)脈臟腑相

13、關(guān)的分子、基因機制,不同證型的基因組表達譜比較,疾病證型演化的基因組表達譜等,這些將是中醫(yī)藥研究的重大領(lǐng)域。3、 結(jié)語當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的一個重要動向是向分子或基因水平深入,不僅 RAPD標(biāo)記技術(shù)和基因芯片技術(shù)，分子生物學(xué)的許多理論和技術(shù)已滲透到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的各種領(lǐng)域,它使得傳統(tǒng)的研究方法和診治手段有了質(zhì)的更新,經(jīng)典科學(xué)概念得以延伸和升華,為從更深層次更本質(zhì)地認識生命現(xiàn)象內(nèi)在的基本規(guī)律開辟了新途徑,也為中醫(yī)藥研究帶來了新的機遇。相信分子生物學(xué)理論和技術(shù)在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用必將極大地推動中醫(yī)理論和臨床實踐向前發(fā)展,迎來我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)發(fā)展史上的又一個春天。參考文獻：1王會玲.淺談分子

14、生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥學(xué)上的應(yīng)用.中國中醫(yī)藥信息雜志,1997,4(11)37382李杰芳.分子生物學(xué)技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,1996,13(3,4)971093ShiLiming，Genetiediversityanditspreservation.ChlneseBiodiversit，1993，i(l):255124曾明,嚴繼舟,張漢明,等.RAPD技術(shù)在葛屬藥用植物分類和鑒定中的應(yīng)用J.中草藥2000,31(8):620-622.5梁之桃,秦民堅,王崢濤,等.柴胡屬5種植物RAPD分析與分類鑒定J.中草藥2002,33(12):1117-1119.6王慧中,盧江杰,施農(nóng)農(nóng)

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