生物催化在藥物合成中的應(yīng)用_百度文庫

1、生物催化在手性藥物合成中的應(yīng)用摘 要 近年來生物催化在藥物合成中的應(yīng)用越來越廣泛,這取決于科學(xué)工作 者在實(shí)驗(yàn)室的潛心研究。 本文綜述了生物催化在藥物合成中的應(yīng)用, 生物催化劑 的優(yōu)化以及生物催化的發(fā)展前景與展望。關(guān)鍵詞 生物催化 手性藥物 生物催化劑 發(fā)展方向生物催化 (biocatalysis也稱生物轉(zhuǎn)化 (biotransformation, bioconversion , 指以 外源性的天然或合成的有機(jī)化合物為底物, 添加至處于活性狀態(tài)的生物體系或酶 系中, 在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng), 使得底物與體系中的酶發(fā)生相互作用, 從而產(chǎn) 生結(jié)構(gòu)改變, 其實(shí)質(zhì)是酶催化反應(yīng)。 生物催化反應(yīng)具條件溫和、

2、 高效及高選性 (化 學(xué)、區(qū)域及立體選擇性等特點(diǎn),被認(rèn)為是一種資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術(shù)。 在過去的幾十年中, 生物催化技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為工業(yè)合成大宗化學(xué)品、 醫(yī)藥中間 體、 活性藥物等物質(zhì)的重要工具, 并有望在醫(yī)藥、 精細(xì)化工等領(lǐng)域取代傳統(tǒng)化學(xué) 合成途徑而成為主要的合成手段。1 生物催化在藥物合成中的應(yīng)用1.1利用生物催化對外消旋化合物進(jìn)行拆分采用生物催化方法對手性化合物的拆分主要是利用酶或微生物對外消旋化 合物中的一種對映體進(jìn)行選擇性催化以達(dá)到拆分的目的。徐毅 1等利用篩選的具 有環(huán)氧水解酶活力的酵母菌凍干細(xì)胞催化拆分消旋的縮水甘油萘基醚合成 S-普 萘洛爾, 篩選到的沙雷氏桿菌在水一有機(jī)溶

3、劑兩相系統(tǒng)中直接催化轉(zhuǎn)化高濃度的 手性環(huán)氧酯底物經(jīng)簡單處理即可獲得光學(xué)純度 >99%的地爾硫卓手性前體; Sugai 等 2用酯酶對合成昆蟲信息素、 -維生素 E 、 D 3及前列腺素似物的重要中間體叔 -苯氧酸酯進(jìn)行促酯化反應(yīng), 得到了 2種不同的異構(gòu)體; Solodenko 等 3以青霉 素?；笇⑴c天然氨基酸極相似的具磷一碳鍵的胺基 -烷基 -磷酸鹽的苯醋的衍 生物進(jìn)行拆分, 得到 了 2個同時具有酶抑制劑及植物生長調(diào)節(jié)劑功能的異構(gòu)體。 1.2不對稱合成反應(yīng)不對稱合成反應(yīng)是將化學(xué)合成的前體轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的手性醇、 酮、 醛、 胺、 酯、 酰胺等衍生物, 也可將含硫、 磷、 氮、 鹵

4、素及金屬的前體轉(zhuǎn)化為手性化合物。 在不對稱合成中引入生物催化技術(shù)愈來愈受到重視,涉及氧化還原酶、合成酶、裂解酶、水解酶、羥化酶、環(huán)氧化酶、醛縮酶等,取得了許多成就,也展示了手 性化合物制備的良好前景 4。如以固定化大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化延胡索酸生產(chǎn)一天 冬氨酸已經(jīng)是成熟技術(shù), 甾體類化合物的不對稱合成也是較早的研究對象。 如穩(wěn) 居 2010年全球最暢銷品牌藥首位的立普妥,其化學(xué)制備方法要從手性池開始, 制備出手性中間產(chǎn)物, 再在嚴(yán)格條件下經(jīng)過側(cè)鏈添加、 羥基保護(hù)和脫氫等多個步 驟制得。而采用生物催化方法,用脫氧核糖 -5-磷酸醛縮酶來催化連續(xù)的醇醛縮 合反應(yīng), 利用氨基醛和乙醛反應(yīng)形成氨基內(nèi)酯, 隨

5、后通過常規(guī)氧化、 保護(hù)和酯化 形成他汀側(cè)鏈。這一生物催化反應(yīng)可具有較高的產(chǎn)量 (200 g /L ·d 及較高收率 (90%一 95% ,最重要的是具有極好的立體控制效果, ee 值和 de 值可分別達(dá)到 98%和 97%。最近有人用不同來源的乙醇脫氫酶分別對對乙烯苯乙酮進(jìn)行不對稱還原, 同 時使用 NADPH 輔酶循環(huán)系統(tǒng),分別得到了 (S一和 (尺 一對乙烯苯乙醇,這 2種 不同構(gòu)型的異構(gòu)體在苯乙烯存在下發(fā)生聚合,得到平均相對分子質(zhì)量為 5000 6000的多聚物,這種多聚物又可以在脂肪酶催化下和醋酸乙烯發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng), 在此過程中,多聚物中僅 (R一部位可以發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng) (如圖

6、1 ,產(chǎn)生的新的多聚 物是性能參數(shù)優(yōu)良的新型材料。 ADH=乙醇脫氫酶; CALB=南極假絲酵母酯酶 B圖 1 芳香酮的不對稱還原反應(yīng)及制備酶反應(yīng)材料的光學(xué)活性單體2 生物催化劑的優(yōu)化2.1定點(diǎn)突變定點(diǎn)突變指通過分析研究蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu), 弄清結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān) 系后, 改變蛋白質(zhì)分子中個別氨基酸殘基, 產(chǎn)生具有新性狀的蛋白質(zhì)。 由于生物 催化劑的本質(zhì)是酶, 因此通過定點(diǎn)突變可以改變它的作用機(jī)制、 底物特異性、 輔 酶特異性、立體專一性以及穩(wěn)定性 5。已經(jīng)成功地利用定點(diǎn)突變提高酶的熱穩(wěn)定 性的例子有很多。 Declerck 等通過定點(diǎn)突變將淀粉酶肽鏈上的天 (門 冬酰胺殘基 敲除,結(jié)果改造

7、過的淀粉酶熱穩(wěn)定性大大提高。 Pichia stipitis中的木糖醇脫氫酶 (PsxDH是木糖醇發(fā)酵生成乙醇的關(guān)鍵酶。 Annalum 等在 PsxDH 中引入一個鋅結(jié) 合環(huán), 然后再對鋅結(jié)合環(huán)進(jìn)行定點(diǎn)突變。 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 突變體比野生型的熱變性溫 度高 10. 8,半衰期溫度高 20. 8。關(guān)于酶或蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性機(jī)制還沒有 完全清楚。但最近一些研究表明,蛋白質(zhì)對熱的耐受性強(qiáng)可能與結(jié)構(gòu)中脯氨酸、 精氨酸、酪氨酸含量高,谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸含量低有關(guān),此外還可能與 非剛性殘基、 鹽鍵和氫的存在狀態(tài)有關(guān)。 與熱穩(wěn)定性相比, 通過定點(diǎn)突變來改變 酶立體選擇性的成功例子相對較少, 因?yàn)橥蛔兠傅牧?/p>

8、體選擇性很難預(yù)測, 但也有 少量報道。 例如, 苯丙二酸羧酶在自然情況下能夠催化苯丙二酸脫羧生成光學(xué)純 的 (R-苯丙酸。 Terao 等 6在苯丙二酸脫羧酶的 74位甘氨酸區(qū)域 (68-77引入半胱氨 酸和用弱酸性的絲氨酸取代 188位的半胱氨酸。 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 有兩種突變酶的立體 選擇性完全翻轉(zhuǎn),并且仍具有催化活性。2.2定向進(jìn)化隨著酶催化研究的逐步深入, 人們發(fā)現(xiàn)酶催化的精確性和有效性常常不能很 好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求。 但由于很多蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu), 以 及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系不是很清楚, 所以不能應(yīng)用定點(diǎn)突變進(jìn)行改造。 近年來 發(fā)展的分子定向進(jìn)化則不需要事先了解蛋白質(zhì)的三

9、維結(jié)構(gòu)信息和作用機(jī)制情況, 直接在體外模擬自然進(jìn)化的過程 (隨機(jī)突變、 重組和選擇 , 使基因發(fā)生大量變異, 并定向選擇出所需性質(zhì)或功能, 即可在較短時間內(nèi)完成漫長的自然進(jìn)化過程。 目 前,定向進(jìn)化常用方法主要有易錯 PCR 和 DNA 改組兩種技術(shù)。易錯 PCR 是指在擴(kuò)增目的基因的同時引入堿基錯配,導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突 變, 產(chǎn)生有利突變體。 它是通過改變 PCR 的反應(yīng)條件來進(jìn)行的, 如調(diào)整 4種 dNTP 的濃度、 增加 M92+的濃度、 加入 Mn2+或使用低保真度 Taq 聚合酶等。 易錯 PCR的關(guān)鍵是控制 DNA 的突變頻率。如果 DNA 的突變頻率太高,產(chǎn)生的絕大多數(shù) 酶將失去

10、活性;如果突變頻率太低,野生型的背景太高,樣品的多樣性則較少。 通過易錯 PCR 來改變酶穩(wěn)定性的例子很多。 Stephens 等 7利用易錯 PCR 對來自 Thermomyce lanuginosus 的內(nèi)向 -1, 4.木聚糖酶進(jìn)行定向進(jìn)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 80下, 野生型的酶在 10min 中內(nèi), 失去 90%的活性, 而突變酶在 80下, 60min 仍具有 7l %的活性,且在 70下,半衰期為 215min 。DNA 改組是將一群密切相關(guān)的序列在 DNase 的作用下將隨機(jī)酶切成小片 段, 這些小片段之間有部分的堿基序列重疊, 它們通過自身引導(dǎo) PCR 交錯延伸, 并重新組裝成全長的

11、基因,又稱有性 PCR 。由于 DNA 改組時 DNA 小片段交錯 延伸模板的不同,使合成的 DNA 片段包含了不同模板 DNA 的信息,這樣親本 基因群中的突變就可以盡可能組合, 導(dǎo)致更大的變異, 并最終獲取最佳突變組合 的蛋白質(zhì)或酶。例如, Fortin 等運(yùn)用易錯 PCR :飽和突變和 DNA 改組對加雙氧 酶 (DoxG進(jìn)行定向進(jìn)化, 得到 DoxG 的變異體 DoxG aMA2:, 其專一性比野生型雙 加氧酶提高了 770倍。當(dāng) DNA 改組用來重組一套與進(jìn)化相關(guān)的基因時,被稱為 family shufling。 Rosic 等 8利用 DNA family shuming對細(xì)胞色素

12、 P450酶進(jìn)行定向 進(jìn)化,結(jié)果增加了細(xì)胞色素 P450酶的多樣性。3結(jié)語與展望由于生物催化劑具有催化效率高、 專一性強(qiáng)和污染少等特點(diǎn), 生物催化已經(jīng) 和化學(xué)方法一樣, 被大量應(yīng)用于藥物的研究開發(fā)。 但生物催化的熱穩(wěn)定性差、 易 受 pH 的影響和有機(jī)溶劑耐受性差等缺點(diǎn),限制了生物催化劑用于大規(guī)模的工業(yè) 化生產(chǎn)。 不過隨著新的生物技術(shù)如定向進(jìn)化的出現(xiàn), 利用生物技術(shù)對生物催化劑 進(jìn)行改造優(yōu)化已成為現(xiàn)實(shí)。 相信在不久的將來, 生物催化定能在制藥工業(yè)中發(fā)揮 更大的作用,給人類的健康事業(yè)作出新的貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)1徐毅,潘江,許建和.環(huán)氧水解酶催化合成 (R一和 (S一普萘洛爾 J.石油化 工, 200

13、4, 33(SI:950 952.2Sugai Takeshi, Ohta Hiromichi. Lipase-mediated efficient preparation of both enantiomers of 2-acetoxytetraoosanoic acid, the inter-mediate for sphingolipidsynthesisJ. Tetra Lett, 1991, 32(48:7063 7064.3Solodenko V A, Belik M Y, Galushko S V, et al. Enzymatic preparation of both L-a

14、nd D-enantiomers of phosphonic and phosphonous analogues of alanine using penicillin acylaseJ. Tetra :Asymm , 1993, 4(9:1965 1968.4Tan J H,Xu J H. Biocatalysis in development of green pharmaceuticalprocessesJ. CurtOpin Chem Biol, 2009, 13(1:43-50.5Bornscheuer U T, Pohl M . Curr . Opin . Chem . Bio1. , 200l , 5(2:137一 1436Terao Y, Ijima