腫瘤靶向性藥物載體葉酸_淀粉納米顆粒的研制與應(yīng)用

1、論 文第51卷 第10期 2006年5月腫瘤靶向性藥物載體葉酸-淀粉納米顆粒的研制與應(yīng)用肖蘇堯 童春義 劉選明* 俞丹密 劉巧玲 薛昌剛 唐冬英 趙李劍(湖南大學生命科學與技術(shù)研究院, 化學生物傳感與計量學國家重點實驗室, 長沙 410082. *聯(lián)系人, E-mail: sw_xml)摘要 用反相微乳液法和交聯(lián)法制備了帶負電的交聯(lián)淀粉納米顆粒(StNP), 經(jīng)過葉酸活性物質(zhì)(FA-PEG-NH2)修飾, 成功制備了葉酸-淀粉納米顆粒(FA-PEG/StNP). 原子力顯微鏡和Zeta-Sizer粒度儀檢測表明所得顆粒的平均直徑約為130 nm. FA-PEG/StNP與抗癌藥物多柔比星(DO

2、X)經(jīng)滲透結(jié)合, 獲得了載藥葉酸-淀粉納米顆粒, 用紫外分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)納米顆粒結(jié)合DOX的飽和量為28 µg/mg, 并對藥物DOX具有明顯的緩釋效果. 經(jīng)過與肝癌細胞BEL7404共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn): 載藥FA-PEG/StNP和載藥StNP的半致死濃度LC50比DOX的半致死濃度明顯提高, 表明FA-PEG/StNP和StNP都能顯著降低DOX的細胞毒性. 而含相同量藥物DOX的載藥FA-PEG/StNP和載藥StNP與肝癌細胞BEL7404共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn): 前者的細胞致死率是后者的3倍, 結(jié)果證實了修飾在顆粒上的FA能顯著提高顆粒對肝癌細胞的靶向作用, 使更多藥物作用于腫瘤細胞,

3、提高了作用效果. 所制備的葉酸-淀粉納米顆粒具有藥物緩釋、靶向識別、降低毒副作用的特點, 可以作為腫瘤靶向性藥物載體.關(guān)鍵詞 葉酸受體 腫瘤細胞 靶向藥物載體 淀粉納米顆粒藥物的低毒和高效對疾病的臨床治療十分重要. 為此, 近年來, 藥物靶向傳遞的研究越來越受到研究者的重視. 自從發(fā)現(xiàn)葉酸受體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細胞膜內(nèi)有大量表達而正常細胞很少有表達以來, 葉酸/葉酸受體介導靶向傳遞的研究成為該領(lǐng)域的熱點問題1. 葉酸是小分子量維生素, 相對于單分子抗體等蛋白質(zhì), 具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價格低廉、無免疫原性等特點, 而且葉酸與葉酸受體結(jié)合力強, 能被高效介導進入腫瘤細胞, 是一種很有應(yīng)用價值的靶向物質(zhì).

4、 結(jié)合到藥物緩釋的要求, 人們又將葉酸通過化學鍵合連接到藥物載體上, 如脂質(zhì)體2,3、多聚物4,5、蛋白質(zhì)6, 以及它們制成的納米顆粒79, 這樣就能有效地同時實現(xiàn)抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的靶向識別和藥物緩釋, 避免藥物對正常細胞的傷害, 提高腫瘤的治療效果.淀粉作為一種天然生物材料, 與其他很多藥物材料相比, 具有很好的生物相容性、無免疫原性, 在空氣中很穩(wěn)定, 與大多數(shù)藥物之間不發(fā)生作用, 在體內(nèi)的降解速度較快, 其水解產(chǎn)物為還原糖, 易在體內(nèi)消化, 而且廉價易得, 長期以來就是醫(yī)藥領(lǐng)域中最常用的藥物填充劑. 近年來發(fā)現(xiàn)淀粉經(jīng)過物理或化學變性還可以獲得更多的特性, 可以作為藥物載體材料廣泛應(yīng)用

5、于醫(yī)藥領(lǐng)域10,11. 作者已成功研制出陰離子交聯(lián)淀粉納米顆粒12. 本文在原有工作基礎(chǔ)上進一步進行淀粉納米顆粒的葉酸生物學修飾, 研制具有腫瘤靶向的葉酸-淀粉納米顆粒, 并對制備的葉酸-淀粉納米顆粒在藥物緩釋、靶向性識別、降低藥物毒副作用等方面進行探討.1 材料與方法1.1 材料試劑: 葉酸(folate, FA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、異硫氰酸熒光素(FITC)、聚乙二醇二氨(PEG-(NH2)2, MW3350)和鹽酸多柔比星(DoxorubicinHCl, DOX)均購自Sigma公 司, 可溶性淀粉等其他試劑均為國產(chǎn)分析純.細胞材料: 肝癌細胞BE

6、L7404, 本實驗室提供. 儀器: SPI-400型原子力顯微鏡(日本精工), Zeta- Sizer粒度儀(英國Malvern公司), UV-1600型紫外可見分光光度計(北京瑞利公司), Axiovert 200 Zeiss熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss 公司), Hitachi F-2500型熒光分光光度計, MK3酶標儀(美國, Thermo Electron), 19HW-1型恒溫磁力攪拌器(中國江蘇), SCIENTZ-D超聲波細胞粉碎機(中國寧波新芝). 1.2 方法() 淀粉納米顆粒的制備. 參照文獻12, 略做修改, 制備方法如下: 稱取1 g可溶性淀粉配成8%的水溶

7、液, 沸水浴中加熱水解, 直到溶液澄清, 室溫放置冷卻. 量取甲苯和氯仿以31的體積比混合, 加入占總體積2%的表面活性劑SPan80, 以 6001151第51卷 第10期 2006年5月論 文r/min的速度攪拌混勻, 形成油相. 取淀粉水解液加入油相中(V油/V水=15/1), 繼續(xù)攪拌一定時間至形成微小的乳液. 加入占淀粉質(zhì)量0.05%的交聯(lián)劑POCl3, 繼續(xù)攪拌反應(yīng)50 min, 用丙酮和乙醇洗滌乳液3次, 冷凍干燥, 即可得到帶負電的交聯(lián)淀粉納米顆粒.() FA-PEG-NH2的制備. FA-PEG-NH2的合成原理如圖1所示, 葉酸的羧基被DCC和NHS活化后與PEG-(NH2

8、)2的一個氨基結(jié)合, 得到FA-PEG-NH2. 具體方法如下: 葉酸13.2 mg葉酸溶于1 mL DMSO, 攪拌下加入一定量的DCC和NHS, 加入100 mg PEG- (NH2)2, 室溫反應(yīng)4 h. 加入5 mL水, 過濾除去不溶物, 上清液冷凍干燥, 乙醚洗滌干燥物, 得到淺黃色固體FA-PEG-NH2. 紅外分光光度法檢測所得固體產(chǎn)物.() FA-PEG/StNP的制備. 稱取1 mg淀粉納米顆粒溶于1 mL去離子水中, 超聲分散, 加入0.1 mg FA-PEG-NH2, 通過氨基與淀粉顆粒結(jié)合, 常溫共育 3 h, 離心洗滌, 沉淀重懸于PBS (pH 7.4), 得到FA

9、- PEG/StNP. 1 mg FA-PEG/StNP懸浮于雙蒸水中, 用-淀粉酶消化除去淀粉, 反應(yīng)條件為37下振搖2 h, 再用紫外可見分光光度計檢測消化液中葉酸的含量, 檢測波長為363 nm, 其他物質(zhì)在該波長處無吸收. 以FA-PEG-NH2的水溶液做標準曲線.() FA-PEG/StNP的原子力顯微鏡檢測. FA- PEG/StNP配制成1 mg/mL的水溶液, 用原子力顯微液做標準曲線.() 藥物釋放檢測. 10 mg 載藥FA-PEG/StNP復合物溶于PBS (pH 7.4)中, 裝于透析袋中, 50 mL PBS (pH 7.4)為透析液, 于37下透析釋放, 100 r

10、/min振蕩, 每隔一定時間取出5 mL透析液, 再加入5 mL PBS以維持透析液的體積. 用紫外可見分光光度計檢測透析液中DOX的量, 檢測波長為480 nm, 以純DOX的PBS溶液做標準曲線.() FA-PEG/StNP與細胞共培養(yǎng). 選對數(shù)生長期的肝癌細胞和正常肝細胞, 用0.25%胰蛋白酶消 化, 以30000個細胞/孔的密度接種于放置了干凈滅菌蓋玻片的細胞培養(yǎng)皿(Costar, Ø35 mm)內(nèi), 加入1.5 mL完全培養(yǎng)基, 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. 在培養(yǎng)皿中加入0.2 mg修飾了熒光物質(zhì)FITC的FA-PEG/StNP, 共培養(yǎng)4 h, 用D-h

11、anks洗滌細胞2次, 取出皿中的蓋玻片, 用95%的乙醇溶液固定蓋玻片上的細胞. 用熒光顯微鏡檢測細胞對熒光納米顆粒的吞噬情況. 在另一些培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿中先加入10 µg純化的葉酸, 共培養(yǎng)4 h, 去除培養(yǎng)液, 用D-hanks洗滌細胞2次, 再加入修飾了熒光物質(zhì)FITC的FA-PEG/StNP共培養(yǎng), 處理方式同上. 以培養(yǎng)皿中加入修飾了FITC的StNP作為對照.() 載藥顆粒對肝癌細胞的抑制作用. 選對數(shù)生長期的肝癌細胞, 用0.25%胰蛋白酶消化, 以2000鏡和Zeta-Sizer電位儀檢測顆粒的形態(tài)、大小和分布.個細胞/孔的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板(Costar)

12、內(nèi),() FA-PEG/StNP裝載抗癌藥物多柔比星(DOX).在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. DOX、載DOX稱取10 mg FA-PEG/StNP溶于5 mL去離子水中, 在的StNP和載DOX的FA-PEG/StNP都溶于PBS (pH溶液中再加入一定量除去鹽酸的DOX, 使得溶液中7.4)中, 以一定的細胞濃度梯度加入到接有細胞的96DOX的濃度分別為0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0 孔培養(yǎng)板中, 在5% CO 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 用mg/mL, 室溫下振蕩共孵育一定時間, 離心洗滌, 沉MTT法檢測細胞的存活率, 得出3種藥劑對肝

13、癌細淀真空干燥, 得到粉末狀載藥納米顆粒. 稱取1 mg胞作用24 h的半致死量濃度. 載藥納米顆粒懸浮于雙蒸水中, 用淀粉酶消化掉淀取載有相同量藥物DOX的載藥StNP和載藥粉, 反應(yīng)條件為37下振搖2 h, 用紫外可見分光光度計檢測消化液中DOX的量, 檢測波長為480 nm, 淀粉和淀粉酶在該波長處無吸收. 以純DOX 的水溶FA-PEG/StNP, 加入到接有細胞的96孔培養(yǎng)板中, 在5% CO2 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 用MTT法檢測藥物對細胞的致死率.圖1 FA-PEG-NH2的合成原理圖論 文第51卷 第10期 2006年5月2 結(jié)果與討論2.1 FA-PEG-NH2的紅外光

14、譜檢測從圖1可知, 若葉酸與PEG-(NH2)2連接成功, 就會在PEG-(NH2)2上引入苯環(huán). 由圖2可見, 相比PEG- (NH2)2的紅外光譜圖, FA-PEG-NH2的紅外圖上出現(xiàn)苯環(huán)的特征峰(1606 cm1), 說明成功制備了FA-PEG- NH2.酸, 檢測波長為363 nm, 得到葉酸的修飾量為0.8 µg/mg. 由實驗結(jié)果可知, 本研究方法能成功地在淀粉納米顆粒表面修飾上葉酸.2.4 FA-PEG/StNP裝載抗癌藥物DOXFA-PEG/StNP的水溶液濃度為2 mg/mL, DOX在反應(yīng)液中的濃度分別為0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5,

15、 2.0 mg/mL, 納米顆粒與DOX共孵育6 h, 離心洗滌, 真空干燥. 載藥顆粒溶于雙蒸水中, 用-淀粉酶消化掉淀粉, 紫外可見分光光度計檢測消化液中DOX的量, 結(jié)果如圖4所示. 從圖4發(fā)現(xiàn)當DOX的濃度高于1.0 mg/mL時, 納米顆粒裝載DOX的量達到飽和, 裝載量約為28 µg/mg.2.5 載藥FA-PEG/StNP中DOX的釋放載藥FA-PEG/StNP溶于PBS(pH 7.4)中, 并以PBS(pH 7.4)為透析液, 37下100 r/min振蕩, 紫外可見分光光度計檢測, 所得結(jié)果見圖5. 由圖5可見, 復合物在前1 h的藥物釋放量為29%, 原因是在透析

16、早期由于吸附在顆粒表面的DOX較易釋放, 所以在曲線上表現(xiàn)出一個突釋過程. 透析10 h后, DOX釋放量達到50%. 48 h后DOX釋放75%, 此時復合物中還載有25%的藥物. 以DOX溶液為對照, DOX在透析h很快就釋放完了. 結(jié)果表明FA-PEG/StNP對DOX具有很好的緩釋作用.2.6 FA-PEG/StNP對肝癌細胞的靶向作用修飾了熒光物質(zhì)FITC 的FA-PEG/StNP與肝癌細胞共培養(yǎng)4 h后, 用熒光顯微鏡觀察并攝像, 結(jié)果圖2 FA-PEG-NH2的紅外光譜檢測圖1, PEG-(NH2)2; 2, FA-PEG-NH22.2 StNP和FA-PEG/StNP的表征用原

17、子力顯微鏡和Zeta-Sizer分析儀檢測StNP和FA-PEG/StNP. StNP的顆粒分散性好, 形狀規(guī)則, 顆粒的平均直徑約為50 nm, Zeta電位為12 mV(未給出圖). FA-PEG/StNP的顆粒直徑主要分布于70 200 nm之間, 平均顆粒直徑約為130 nm(圖3所示). 2.3 FA-PEG/StNP中葉酸的量紫外可見分光光度計檢測FA-PEG/StNP中的葉 見圖6. 從圖6可見, 肝癌細胞攝取的熒光顆粒數(shù)量圖3 FA-PEG/StNP的顆粒分布圖(a) AFM檢測圖, (b) Zeta-Sizer檢測圖. 用于檢測的復合物濃度為1 mg/mL1153第51卷 第

18、10期 2006年5月論 文結(jié)果表明: 通過葉酸受體介導可以顯著提高肝癌細胞對FA-PEG/StNP的吞噬能力, 培養(yǎng)基中加入游離葉酸后, 由于游離葉酸優(yōu)先結(jié)合了腫瘤細胞表面的部分葉酸受體, 從而降低了腫瘤細胞對熒光顆粒的吞噬能力.用熒光分光光度計檢測細胞破碎液的熒光強度實驗進一步證實了FA-PEG/StNP對肝癌細胞的靶向作用. 取上述相同量共培養(yǎng)的細胞用TritonX100-PBS緩沖溶液破碎, 檢測結(jié)果如圖7所示. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與FA-PEG/StNP共培養(yǎng)的細胞液熒光強度約為對照液熒光強度的20倍. MTT實驗表明1, 2, 3實驗組的細胞量和細胞活性大體相當.載體納米顆粒對肝癌細胞藥物D

19、OX的半致死濃度影響. 以5000個/10 µL的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi), 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. 加入不同量的DOX, StNP/DOX和載藥FA-PEG/StNP的PBS(pH 7.4)溶液, 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h, 用MTT法檢測細胞的存活率, 結(jié)果見表1. 從表可知, DOX, 載藥StNP和載藥FA-PEG/StNP的半致死濃度分別為5×105, 8.4×104和2.6×104 mol/L(以純DOX在培養(yǎng)基中的終濃度計), 其中載藥StNP的半致死濃度約為DOX的17倍, 表明結(jié)合淀粉納米顆粒圖4

20、 不同藥物濃度下淀粉納米顆粒裝載DOX的量誤差棒由標準誤差S得到, 其中n = 4. *, P < 0.01, 有顯著性差異;#, P > 0.05, 表明后三組之間無顯著性差異圖5 載藥顆粒中DOX的釋放曲線和DOX的釋放曲線實心點線為載藥FA-PEG/StNP復合物的釋放曲線, 空心點線為DOX溶液的釋放曲線. 誤差棒由標準誤差S得到, 其中n = 3載體降低了抗癌藥物DOX的細胞毒性, 載藥圖7 肝癌細胞攝取熒光顆粒的定量檢測CK, 對照; 1, FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于肝癌細胞; 2, FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于正常細胞; 3, FITC修

21、飾的FA-PEG/StNP+圖6 肝癌細胞對熒光顆粒的攝取游離葉酸作用于肝癌細胞誤差棒由標準誤差S得到, 其中n = 3.*, P < 0.01, 表明三個實驗組與對照之間具有顯著性差異(a) FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于肝癌細胞; (c) FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于正常細胞; (e) FITC修飾的FA-PEG/StNP+游離葉酸作用于肝癌細胞. (b), (d), (f)為(a), (c), (e)對應(yīng)的明視圖表1 DOX和不同載藥顆粒對肝癌細胞BEL7404的DOX半致死濃度的影響DOX或載藥顆粒 DOX 載藥StNP 載藥FA-PEG/StNP半致死

22、濃度LC50(以DOX終濃度計)5×105 mol/L 8.4×104 mol/L 2.6×104 mol/L多(圖6(a)和(b), 而正常肝細胞對熒光顆粒的攝取較少(圖6(c)和(d), 在培養(yǎng)基中加了游離葉酸后, 肝癌細胞對熒光顆粒的攝取量又明顯降低(圖6(e)和(f).論 文第51卷 第10期 2006年5月FA-PEG/StNP的半致死濃度較載藥StNP的低, 可能是因為載藥FA-PEG/StNP復合物表面修飾的葉酸與腫瘤細胞表面葉酸受體結(jié)合, 介導顆粒進入細胞, 從而更有效地抑制腫瘤細胞生長.此外, 我們進行了不同載藥顆粒對肝癌細胞BEL7404的致死

23、率的影響實驗: 在接了肝癌細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中加入一定量的StNP, FA-PEG/StNP, 載藥StNP, 載藥FA-PEG/StNP和載藥FA-PEG/StNP+游離FA, 培養(yǎng)24 h后, 用MTT法檢測得到細胞的致死率, 結(jié)果見圖8. 由圖8可知, StNP與FA-PEG/StNP兩種顆粒的細胞致死率都很低, 載藥FA-PEG-StNP的致死率最高, 約為載藥StNP的1倍, 而載藥FA-PEG/StNP+FA的致死率則與載藥StNP的相當. 結(jié)果進一步證實說明這兩種納米顆粒的細胞毒性低, 而載藥FA-PEG/StNP中的FA能夠作為靶向物質(zhì)有效地介導顆粒進入肝癌細胞.2有研究表

24、明, 顆粒越大, 其載藥量越大, 藥物的釋放則相應(yīng)減慢. 我們還需要對所制備的顆粒的大小與載藥量和藥物釋放之間的關(guān)系進行進一步的研究. 另外, 淀粉納米顆粒究竟結(jié)合多少葉酸, 才能達到最佳靶向效果; 靶向載體在體外與在體內(nèi)的靶向效果是否一致, 這些都需要深入探討.致謝 本工作為湖南省重點科技項目(批準號: 03NKY1001).參 考 文 獻1 Christopher P L, Philip S L. Delivery of macromolecules into liv-ing cells: a method that exploits folate receptor endocytosis

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