實驗二十五基因重組實驗Ⅳ——重組體的篩選與鑒定

1、實驗二十五基因重組實驗W重組體的篩選與鑒定 原理 限制性內(nèi)切核酸酶酶切鑒定： 具體原理見實驗二PCF 反應鑒定：具體原理見實驗十八。 試劑 1、DNA 模板2、引物3、Taq DNA 聚合酶4、dNTPs（dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP）5、10 xPCR 反應緩沖液： 100mmol/L Tris-HCI pH8.3 , 500mmol/L KCl , 15mmol/L MgCb, 0.1%明膠6、礦物油1、超純水8、EcoRI 酶解反應液（ 10 x）: 1mol/L pH7.5實驗二十五基因重組實驗W重組體的篩選與鑒定Tris-HCl , 0.5mol/L NaCl , 0

2、.1mol/L MgCl1 / 89、HindIII 酶解反應液（10X）: 1mol/L pH7.4Tris-HCl , 1mol/L NaCl , 0.07mol/L MgCl2。3.50 xTAE 電泳緩沖液：稱取 242 克 Tris ,加入57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA ，調(diào)節(jié) pH 至 8.0 ，加蒸餾水至 1000ml。10、. 凝膠加樣緩沖液：0.25%溴酚藍、0.25%二 甲苯青 FF、 40%蔗糖水溶液（ w/v）。11 、 1%（ 1.5%）瓊脂糖凝膠： 1xTAE 100ml 含1g（ 1.5g ）瓊脂糖。 器材 1、DNA 擴增儀2、電泳

3、儀、電泳槽3、微量移液器4、紫外投射儀5、0.5ml 塑料離心管2 / 86、樣品槽模板（梳子）7、錐型瓶（100ml 或 50ml）8次性塑料手套9、凝膠成像系統(tǒng)操作步驟1.酶切反應體系的建立（20 卩 l 反應體系） 按下表要求配制酶切反應體系質(zhì)粒 DNA6 卩 l10XBuffer2 卩 lHindIII1 卩 lH2O10 卩 lEcoR I1 111混勻后置 37C水浴 3h。2. PCR 反應體系的制備（25il 反應體系）按下表要求配制酶切反應體系DNA21110XBuffer2.51ldNTP0.111H2O17.21Primer-10.111TaqE11lPrimer-20.

4、11150%甘油21l混勻后，2000rpm 離心 30sec,然后按94C5min94C40sbc3 / 855CJ40sec35cycles72C90sec72C3min3.電泳： 1%瓊脂糖凝膠（酶切）和 1.5%瓊脂糖凝膠（PCF 反應）將 20 卩 l 酶切和 PCF 產(chǎn)物進行電泳，觀察結果。Vocabulary in Biochemical technologyAAbsorbance吸光度Absorbent吸附劑Absorption chromatography吸附層析Absorption spectrum吸收光譜Acrylamide, Aa/Acr丙烯酰胺（單體）Adenine,

5、 A腺嘌呤Affinity chromatography親和層析Agarose瓊脂糖Agarose gel electrophoresis ，AGE瓊脂糖凝膠電泳Allele specific oligonucleotide, ASO等位基因特異性寡核苷酸雜交Ammonium persulfate, AP過硫酸胺Angle rotor角式轉(zhuǎn)頭Anion exchange chromatography陰離子交換層析4 / 8CCarrier ampholyte載體兩性電解質(zhì)Cation exchange chromatography陽離子交換層析Cellulose acetate membran

6、eelectro醋酸纖維薄膜電泳-phoresis ，（CAME ）Cellulose ion-exchangers纖維素離子交換劑Centrifuge離心機Centrifugal force離心力Centrifugal technique離心技術Coenzyme輔酶Column chromatography柱層析Cytosine, C胞嘧啶Denature gradient gelD eletro變性梯度凝膠電泳-phoresis , DGGEDeoxyribonucleic acid, DNA脫氧核糖核酸Dialysis透析Differential centrifugation差速離心Discontinuous PAGE不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳Eletro-osmosisE電滲Emission spectrum發(fā)射光譜Exclusion chromatographyG排阻層析Gel chromatography凝膠層析Gel filtratio