植物組織MDA含量測(cè)定

1、植物組織MDA含量測(cè)定、目的要求1 掌握植物組織MDA含量測(cè)定的原理及具體測(cè)量步驟；2 深化理解MDA與逆境和衰老的關(guān)系，理解植物組織 MDA含量測(cè)定的意義;3了解膜脂過氧化、氧自由基和 MDA形成的關(guān)系；4能夠根據(jù)待測(cè)材料的具體情況設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟測(cè)定MDA含量；5 學(xué)習(xí)分光光度計(jì)，低溫離心機(jī)等儀器的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理植物遭受逆境脅迫或衰老時(shí)，體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質(zhì)含量下 降、葉綠素降解、光合作用降低，活性氧平衡失調(diào)及內(nèi)源激素平衡失調(diào)等?；钚匝醮x失調(diào) 直接導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧的大量積累，從而引發(fā)或加劇膜脂過氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的 損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。膜脂

2、過氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛(Malondialdehyde, MDA )是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。 因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過測(cè)定 MDA 了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。MDA在高溫及酸性環(huán)境下可與2-硫代巴比妥酸(TBA )反應(yīng)，產(chǎn)生紅棕色的產(chǎn)物3,5,5- 三甲基惡唑2,4-二酮(Trimetnine),又名三甲川，該物質(zhì)在 532nm處有最大光吸收，在 600nm處有最小光吸收。由于TBA也可與其它物質(zhì)反應(yīng)，并在532nm處有吸收，為消除硫代

3、巴比妥酸與其它物質(zhì)反應(yīng)的影響，同時(shí)測(cè)定 600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸 光度的差值計(jì)算MDA的濃度。即：A532 A600= £G-L式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值，G是MDA濃度，L為比色杯厚度，& =155L - mniOlcm-1。MDA3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮需要指出的是，植物組織中糖類物質(zhì)可能對(duì) MDA-TBA反應(yīng)有干擾作用?？捎孟铝泄较烧崽且鸬恼`差_1G (卩 mol - L =6.45 心532 A600) 0.56 A450、材料與設(shè)備1 材料：四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處

4、理和室溫對(duì)照。2儀器: 分光光度計(jì)； 冷凍離心機(jī)；（3）水浴鍋； 天平；（5）研缽； 剪刀；（7） 5ml刻度 離心管；（9）刻度試管（10ml） ； （10）鑷子；（11）移液管（5ml、2ml、1ml） ； （ 12）冰箱。3藥品（1） 0.05mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液； 5%三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水 溶解，然后定容到100ml； （3） 0.5%的TBA溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5%三氯乙酸溶 解，定容至100ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. MDA的提取：取樣品0.5g （W），加入2ml預(yù)冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸緩沖液， 冰浴研磨成勻漿，

5、轉(zhuǎn)移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。4500rpm，4度，離心10min,上清液即為MDA提取液，測(cè)量 提取液的體積（V ）。2. MDA含量測(cè)定：吸2ml （V2）的提取液于刻度試管中（空白為 2ml緩沖液），加入 3ml 0.5%的TBA溶液，將試管放入沸水浴中煮沸10 min （自試管內(nèi)溶液中出現(xiàn)小氣泡開始計(jì) 時(shí)）。到時(shí)間后，立即將試管取出并放入冰浴中。 4500rpm，4度，離心10min，取上清液并 量其體積（V1）。上清液于532nm、600nm波長下測(cè)定吸光度。3. 結(jié)果計(jì)算：VV2 W-1MDA(nmolg )= 6.4

6、52 (A532 A600)式中，V1為反應(yīng)液總量（ml） ； V2為反應(yīng)液中的提取液數(shù)量（ml） ； V為提取液總量（ml）； W為植物樣品重量（g）。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告？樣品處理重復(fù)A532A600MDA 含量(nmol g-1)綠葉高溫處理123平均標(biāo)準(zhǔn)差室溫對(duì)照123平均標(biāo)準(zhǔn)差黃葉高溫處理121. TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？2提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時(shí)間又不能過長？3. 為什么要測(cè)定反應(yīng)液在 600nm下的吸光度？4. 如果可溶性糖含量影響 MDA含量的測(cè)定，你有什么辦法消除其影響?5. 正常植物與衰老時(shí)相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。七、注意事項(xiàng)1.可溶性糖與TBA顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm）,當(dāng)植物處于 干旱、高溫、低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高，必要時(shí)要排除