海帶中褐藻糖膠的超聲提取工藝的優(yōu)化

1、海帶中褐藻糖膠的超聲提取工藝的優(yōu)化                        作者：賁永光，鐘紅茂，吳曉燕【摘要】  目的研究以水為溶劑超聲波強(qiáng)化提取海帶褐藻糖膠的工藝。方法 采用正交設(shè)計(jì),以超聲提取時(shí)間、超聲功率、固液比和提取溫度為考察因素,優(yōu)選了超聲波提取海帶中褐藻糖膠的最佳工藝。結(jié)果 各因素對(duì)提取率的影響大小依次為:超聲提取時(shí)間>固液比>

2、;提取溫度>超聲功率，優(yōu)選的最佳提取工藝為:超聲作用時(shí)間30 min，固液比130，提取溫度40 ，超聲功率320 W。按此條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)得褐藻糖膠的提取量為19.89 mg?g-1。結(jié)論 較之傳統(tǒng)提取方法，超聲法提取海帶中褐藻糖膠具有省時(shí)、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。 【關(guān)鍵詞】  超聲波;海帶;褐藻糖膠;提取工藝Abstract:ObjectiveTo study on ultrasound extraction of fucoidan from Laminaria Japonica process with water.Methods The orthogonal experime

3、nt was designed with ultrasound time,ultrasound power,solid-liquid ratio and extraction temperature as factors to optimize the extraction process of fucoidan.Results Various factors on the extraction rate were in sequence:ultrasound time,solid-liquid ratio,extraction temperature,ultrasound power.The

4、 optimal process were as follows:the extraction time for 30 min,solid-liquid ratio of 130,40 temperature and ultrasound power of 320 W.Repeated experiments in this condition resulted yielding fucoidan of 19.89 mg?g-1.Conclusion Compared with conventional methods,ultrasound extraction has many advant

5、ages such as time-saving,energy conservation and so on.Key words:ultrasound; Laminaria Japonica; fucoidan; extraction process海帶(Laminaria japonica Aresch)中的褐藻多糖硫酸酯又稱為褐藻糖膠(fucoidan)、巖藻聚糖硫酸酯、巖藻聚糖，是一種存在于所有褐藻中的細(xì)胞間的水溶性雜多糖。其主要成分除了L-巖藻糖外，還含有半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和K、Na、Ca、Mg等金屬離子。褐藻糖膠溶于水，不溶于乙醇、丙酮、三氯甲烷等有機(jī)溶劑。

6、據(jù)報(bào)道1，從不同海洋生物中提取得到的褐藻糖膠酸堿性不同：從裙帶菜中提取得到的褐藻糖膠水溶液的pH值為8.50，呈弱堿性;而由海帶中提取得到的褐藻糖膠水溶液的pH值為6.46，為弱酸性。近年來研究不斷表明，海帶中的褐藻糖膠具有廣泛的生理活性2-3，如抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗輻射、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等。很多學(xué)者對(duì)海帶多糖的提取方法進(jìn)行了研究探討，傳統(tǒng)方法主要為酸提取法、堿提取法、酶提取法等4，均存在一定的缺陷。如酸提取法可造成多糖水解;堿提取法造成多糖生物活性降低;酶提取法耗時(shí)較長(zhǎng)，且工業(yè)生產(chǎn)需要使用的酶量大、成本高;熱水提取醇沉的方法較簡(jiǎn)便，但是耗時(shí)耗能?？梢妭鹘y(tǒng)的提取工藝能

7、耗大、時(shí)間長(zhǎng)，且易破壞海帶中的有效成分，故距實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用還有很大距離。超聲提取作為一種新型的提取工藝，具有節(jié)能、省時(shí)、高效的特點(diǎn)5-7，故本試驗(yàn)將其應(yīng)用于海帶中褐藻糖膠的提取，旨在確定超聲提取海帶中褐藻糖膠的最佳工藝條件，為其工業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。1儀器與試劑1.1儀器HH-6恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠);RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市英峪予華儀器廠);予華牌循環(huán)水真空泵(河南省鞏義市英峪予華儀器廠);UV1101紫外-可見分光光度儀(上海天美科學(xué)儀器有限公司);AY120電子分析天平(日本島津公司);KH-400KDB型高功率數(shù)控超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，頻率40 kH

8、z，功率400 W);搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(大德中藥機(jī)械有限公司)。1.2試劑海帶購(gòu)自廣州市清平市場(chǎng)，經(jīng)中科院南海海洋研究所鐘紅茂研究員鑒定為海帶目海帶科的一種大型褐藻Laminaria japonica Aresch，曬干后粉碎至40目備用。葡萄糖對(duì)照品(分析純，純度99%,廣州汕頭市西隴化工廠)。實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純。2方法2.1葡萄糖對(duì)照品溶液的制備精密稱取葡萄糖對(duì)照品50.0 mg，置100 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含葡萄糖0.500 mg)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取上述葡萄糖對(duì)照品溶液1.0、2?0、3.0、4.0、5.0、6.0、8

9、.0、10.0、12.0 mL至50 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取2.0 mL于試管中，于冰水浴條件下緩慢加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸溶液5.0 mL，振搖5 min，沸水浴15 min，然后置冷水浴中冷卻20 min。取1.0 mL蒸餾水，加等量苯酚和濃硫酸,同法操作,作為空白溶液,在 490 nm處測(cè)量其吸光度值。以葡萄糖的質(zhì)量濃度()為橫坐標(biāo),溶液的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=26.894+0.030 2，r=0.999 7葡萄糖的質(zhì)量濃度在0.002 50.030 0 mg?mL-1范圍

10、內(nèi)與吸收值線性關(guān)系良好。2.3海帶褐藻糖膠提取液的制備取海帶粉末(40目)5.0 g，按試驗(yàn)要求以不同超聲提取時(shí)間、超聲功率、固液比和提取溫度進(jìn)行提取，得到的上清液濃縮至體積為原來的1/3，加入3倍體積的95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，離心，得到的沉淀用丙酮洗滌，得到褐藻糖膠粗品。將粗品溶于蒸餾水中，減壓抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移入100 mL的容量瓶中，定容,即得。2.4褐藻糖膠的提取量的計(jì)算按下列公式計(jì)算褐藻糖膠的提取量：EY=x1(mg)x0(g)式中：EY為海帶中褐藻糖膠的提取量(mg?g-1)，x0為提取前海帶粉末的質(zhì)量(g)，x1為提取物中褐藻糖膠的質(zhì)量(mg)。2.5單因素試驗(yàn)2.5.1超聲提取溫

11、度的影響稱取含海帶粉末5?0 g、固液比為120的樣品溶液，分別在30、40、50、60 的水浴，以320 W的功率超聲30 min，其他步驟同“2.3”。隨著溫度的升高，褐藻糖膠的提取量迅速增大，當(dāng)溫度升高到50 時(shí)，提取量的增大速度減慢，直至趨于平衡。故褐藻糖膠的提取應(yīng)控制在一定的溫度范圍內(nèi)。2.5.2超聲功率的影響稱取含海帶粉末5.0 g、固液比為120的樣品溶液，于40 的水浴中，以200、240、280、320、360、400 W功率分別超聲30 min，其他步驟同“2.3”。在超聲功率為200320 W范圍內(nèi)，褐藻糖膠的提取量隨超聲功率的提高而增大，在功率為320 W時(shí)，提取量達(dá)到

12、峰值。2.5.3超聲提取時(shí)間的影響稱取含海帶粉末5?0 g、固液比為120的樣品溶液，在40 的水浴中，以320 W的功率分別超聲10、20、30、40、50、60 min，其他步驟同“2.3”。在提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取量達(dá)到最大值32 mg?g-1。此后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，提取量反而減小。2.5.4固液比的影響稱取含海帶粉末5.0 g、固液比分別為110、115、120、125、130、135、140的樣品溶液，在40 的水浴中，以320 W的功率超聲30 min， 其他步驟同“2.3”。 在固液比為 120130的范圍內(nèi)，提取量迅速增大，曲線的斜率明顯增大。但在130140的范圍內(nèi)，褐

13、藻糖膠提取量的增大趨于平緩。2.6正交試驗(yàn)以超聲提取時(shí)間、超聲功率、固液比和超聲提取溫度為因素，設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn)，因素水平表見表1。正交試驗(yàn)中每個(gè)試驗(yàn)的海帶粉末質(zhì)量均為5.0 g。2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)稱取海帶粉末5.0 g，精密稱定。以優(yōu)選出來的最佳提取工藝重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定褐藻糖膠的提取量。3結(jié)果與分析3.1正交試驗(yàn)正交試驗(yàn)結(jié)果如表2、3所示。表1因素水平表表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與直觀分析表3方差分析表由表中可知，4個(gè)因素對(duì)褐藻糖膠提取量的影響程度由大到小依次為：C>D>A>B，即提取時(shí)間>固液比>提取溫度>提取功率，優(yōu)化工藝條件為A2B2C2D3，即：提

14、取時(shí)間為30 min，固液比為130，溫度為40 ，功率為320 W。3.2驗(yàn)證試驗(yàn)3次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)得褐藻糖膠的提取量分別為19.86、19.88和19.93 mg?g-1，平均提取量為19?89 mg?g-1，RSD為1.51%，結(jié)果穩(wěn)定，表明該工藝合理可行。3.3超聲提取與常規(guī)提取方法的比較比較了超聲提取法與常規(guī)提取法的提取結(jié)果，見表4。表4超聲法和常規(guī)提取法提取效果比較4討論4.1本試驗(yàn)對(duì)超聲法、水提法、酸提法所得褐藻糖膠提取量進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果顯示，超聲提取2次，每次30 min所得的海帶褐藻糖膠提取量與100 熱水提取5 h相當(dāng)，可大大縮短提取時(shí)間。且經(jīng)熱水提取離心所得的提取液呈深棕色，

15、明顯比超聲提取的提取液顏色深，提示利用超聲波作為海洋生物多糖提取手段能有效減少色素的析出，在實(shí)際應(yīng)用中可簡(jiǎn)化除色素等預(yù)處理步驟。通過對(duì)超聲提取與常規(guī)提取方法的對(duì)比可知，超聲提取具有時(shí)間短、能耗低等優(yōu)勢(shì)，且提取工作在低溫下進(jìn)行，可避免高溫對(duì)提取成分的破壞，同時(shí)可以減少提取過程中色素的析出。故超聲提取技術(shù)是一種良好的多糖提取新工藝，具有很好的發(fā)展前景。4.2本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)海帶中褐藻糖膠超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，研究結(jié)果表明超聲法提取海帶中褐藻糖膠的最佳工藝條件為：提取時(shí)間30 min，固液比130，提取溫度40 ，超聲功率320 W?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 孔鵬,姚翠鸞,齊麗薇,等.海帶多糖的抗衰老作用及其機(jī)理的研究J.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,30(4):65-67.2 周裔彬，汪東風(fēng)，杜先鋒,等.酸化法提取海帶多糖及其純化的研究J.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(3)：103-107.3馬劍茵，王銑，徐勇飛.海帶褐藻多糖硫酸酯對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用J.中國(guó)海洋藥物雜志，2009，28(6)：40-42.4 郭亞貞.海帶中褐藻糖膠的提取與純化J.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,9(3