桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA的提取及PCR反應(yīng)體系優(yōu)化_圖文

1、2009; 35(2 蠶業(yè)科學(xué)CAN Y E KEXUE 收稿日期:2008-03-26資助項目:河北省強勢特色學(xué)科桑天牛成蟲腸道細菌多樣性研究項目(編號2008013 。作者簡介:袁秀潔(1982- , 女, 河北, 碩士研究生。通訊作者:李會平, 博士, 副教授。黃大莊, 教授, 博士生導(dǎo)師。桑天牛成蟲腸道細菌基因組D NA 的提取及PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化袁秀潔李會平黃大莊黃秋嫻蘇筱雨侯曉杰(河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北保定071000摘要為了建立一套適用于桑天牛腸道細菌多樣性研究的PCR 反應(yīng)體系和程序, 采用改良的十六烷基三乙基溴化銨(CT AB 法提取桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA, 通過L

2、16(45 正交組合試驗和單因素梯度試驗對MgCl 2、d NTP 、隨機引物、Taq DNA 聚合酶、模板DNA 的濃度和退火溫度、循環(huán)次數(shù)等影響PCR 擴增的重要因素進行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明, 采用改良的CT AB 方法提取的桑天牛成蟲腸道細菌DNA , 適宜于。25LPCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序中各因素優(yōu)化組合為:10Buffer 215200隨機引物0148mol/L,Taq DNA 聚合酶0175U, 模板DNA , 關(guān)鍵詞桑天牛; ; 中圖分類號. . B 文章編號0257-4799(2009 02-0379-05m i c DNA Extracti on and Optim i za

3、ti on of PCR Reacti onSyste m of Apriona germ a ri I ntesti n al Bacter i aY UAN Xiu 2J ie L I Hui 2Ping 3HUANG Da 2Zhuang 3HUANG Q iu 2XianS U Xiao 2Yu HOU Xiao 2J ie(H e b e i A g ric u ltu ra l U n ive rs ity, B a od ing H e b e i 071000, C h ina A b s tra c t In o rd e r to e s ta b lis h op ti

4、m a l PCR (p o lym e ra s e c ha i n re a c ti on s ys tem a nd p roc e d u re fo r s tud ying the d ive rs ity of Ap riona g e r m a ri in te s ti na l b a c te ria, a m od ifi e d C T AB (he xa d e c yl tri m e thyl am m on ium b rom i d e m e thod w a s em p l oye d to e xtra c t g e nom ic DNA o

5、f the Ap riona g e r m a ri i n te s tina l b a c te ria. S e ve ra l i m p o rta n t fa c to rs i nc lud ing M gC l 2, dN TP, ra nd om p rim e r, Ta q p o lym e ra s e a nd tem p la te DNA w e re op ti m i ze d th roug h L 16(45o rthog ona lly d e s i g ne d e xp e ri m e n t . A nne a li ng tem p

6、e ra tu re a nd num b e r of am p lific a ti on c yc l e s w e reop ti m ize d th roug h s i ng le fa c to r e xp e ri m e n t . The re s u lts s how e d tha t h ig h q ua lity g e nom ic DNA c ou ld b e ob 2ta i ne d fo r PCR a na l ys e s b y the m od i fie d C T AB m e thod. The op ti m a l re a

7、c tion s ys tem fo r PCR a na lys i s w a s a s fo llow s:a to ta l vo lum e of 25L PCR re a c tion m i xtu re c on ta i n i ng 215L of 10b uffe r, 210m m o l/Lof M gC l 2, 012m m o l/Lof dN TP, 0148m o l/Lof ra nd om p ri m e r, 0175U of Ta q p o l ym e ra s e, 75ng of tem p l a te DNA, a nd a nne

8、a ling tem p e ra tu re a s 60fo r 30c yc le s of am p lifi c a tion.Ke y w o rd s Ap riona g e r m a ri ; In te s ti na l b a c te ria l g e nom ic DNA; PCR re a c tion s ys tem ; O rthog ona l c om b i na 2tion; S ing l e fa c to r昆蟲腸道存在大量微生物, 其中大部分為細菌。這些腸道微生物通過微生態(tài)調(diào)節(jié)而影響到昆蟲的生命活動, 因此與昆蟲的免疫能力和營養(yǎng)取食之間存

9、在密切的關(guān)系。近年來, 微生物生態(tài)學(xué)的研究日趨完善, 對于以昆蟲腸道微生態(tài)和腸道微生物研究為核心的害蟲防治方法的探索也已成為研究的熱點之一。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在微生物培養(yǎng)中的廣泛應(yīng)用, 又為微生物生態(tài)學(xué)的研究和利用開辟了新的技術(shù)途徑。973桑天牛(A priona ger m ari 屬鞘翅目昆蟲, 是多種林木、果樹、花卉的主要蛀干害蟲, 也是近年來我國危害最嚴重、最難防治的林木害蟲之一1。目前關(guān)于桑天牛的防治研究主要集中于利用白僵菌以及卵寄生蜂的生物防治等方面2-8, 而從微生物生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度研究桑天牛腸道細菌, 探索桑天牛防治的新途徑卻鮮見報道?；蚪MDNA 提取及PCR 擴增

10、是利用分子生物學(xué)技術(shù)研究腸道微生物的前提, 因此本試驗以微生物生態(tài)學(xué)為理論基礎(chǔ), 對桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA 的提取方法以及PCR 反應(yīng)條件進行了探索, 旨在建立一套適用于利用分子生物學(xué)技術(shù)方法研究桑天牛腸道細菌多樣性的PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。111111111試驗材料2008年79月從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標本園捕獲桑天牛成蟲, 饑餓過夜后放入75%乙醇溶液中浸泡3m in 殺死, 在無菌條件下取出蟲體并放在011%二氯化汞溶液中消毒2m in, 移入滅菌水中清洗3次, 然后進行無菌解剖, 取出腸道, 置于-20保存?zhèn)溆谩?1112主要試劑引物、Taq DNA 聚合酶、和DL 2000lad

11、der marker 購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司, d NTP 、goldvie w 和瓊脂糖購于北京鈞堯偉業(yè)生物技術(shù)中心, 十六烷基三乙基溴化銨(CT AB 購于北京夏新生物技術(shù)有限公司。112試驗方法11211桑天牛腸道細菌基因組DNA 提取取出1條保存?zhèn)溆玫纳Ｌ炫３上x腸道, 放入研缽中, 加入少量液氮進行冷凍研磨。研磨后裝入115mL 離心管中, 加入1mL CT AB 提取緩沖液, 渦旋振蕩器上震蕩混勻5s 。65水浴1h, 期間每隔20m in 輕輕搖勻數(shù)次。水浴后使之冷卻至室溫, 用大口徑槍頭進行分裝。然后加入等體積的V (酚 V (氯仿 V (異戊醇 =25241混合液

12、, 輕輕搖勻, 10000r/min 離心10m in, 用大口徑槍頭吸取上清液于另一新離心管中。按照上一步驟重復(fù)抽提23次, 直到水相和有機相交界處不再有白色沉淀物。在上清液中加入1/10體積的3mol/LNaAc (pH =512 和2倍體積冰冷100%乙醇, 輕彈或翻轉(zhuǎn)混勻, 置于-20冰箱中沉淀10m in 。12000r/min 離心15m in, 棄上清液。沉淀中加入70%乙醇1mL , 000r/min 離心3m 15m in 。然515L 和L , 37水浴1h 溶解DNA 并去除RNA , -20冰箱中保存?zhèn)溆谩?1212PCR 反應(yīng)體系的正交組合優(yōu)化設(shè)計采用L 16(45正

13、交試驗設(shè)計, 在25L 反應(yīng)體系中, 設(shè)計Mg 2+濃度、dNTP 濃度、Taq DNA 聚合酶含量、引物濃度、模板DNA 質(zhì)量5因素4水平(表1 16個組合(表2 。引物選用細菌通用引物(27f:52G AG AGT 2TTG AT CCTGGCTCAG 23, 由上海生物工程有限公司合成。設(shè)計PCR 擴增的基本反應(yīng)程序為:95預(yù)變性2m in; 94變性30s, 60退火1m in,72延伸4m in, 共30次循環(huán); 72延伸10m in 。PCR 產(chǎn)物在115%瓊脂糖凝膠上進行電泳, 采用DL2000DNA ladder 分子量標準, 在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相。11213PCR

14、反應(yīng)程序的單因素優(yōu)化設(shè)計以上述方法選取的最優(yōu)組合為反應(yīng)體系, 對PCR 反應(yīng)程序中的退火溫度和循環(huán)次數(shù)進行單因素梯度優(yōu)化篩選, 并分析比較這2個因素對擴增條帶清晰度的影響。退火溫度設(shè)計58、60、63、654個梯度; 循環(huán)次數(shù)設(shè)計25、30、35次3個梯度。表1PCR 反應(yīng)體系正交組合各因素水平設(shè)計Table 1O rthogonal design of five fact ors at four levels for PCR reacti on syste m水平Level 因素Fact orMg 2+濃度/(mmol L -1 Mg 2+concentrati ondNTP 濃度/(mmo

15、l L -1 dNTP concentrati on引物濃度/(mol L -1Pri m er concentrati onTag 酶含量/UTag poly merasecontent模板DNA 質(zhì)量/ngTe mp late DNA1310012001561125100表2PCR 反應(yīng)體系的L 16(45 正交組合設(shè)計試驗方案Table 2Experi m ental sche me of orthogonally designed PCR reacti on syste m 編號No 1Mg 2+濃度/(mmol L -1 Mg 2+concentrati ondNTP 濃度/(mmo

16、l L -1 dNTP concentrati on引物濃度/(mol L -1 Pri m er concentrati onTag 酶含量/U Tag poly merasecontent 模板DNA 質(zhì)量/ngTe mp late DNA3100108014011001002結(jié)果與分析211桑天牛腸道細菌基因組DNA 的提取效果用“11211”所述改良CT AB 法提取桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA 的凝膠電泳圖譜完整性較好, 條帶整齊明亮, 無拖尾現(xiàn)象(圖1 , 說明所提取的DNA 純度較高, 適合用于PCR 擴增。 泳道1、2分別為同一DNA 樣品的2個重復(fù)Lanes 1and 2:

17、T wo repeats of the sa me DNA sa mp le圖1桑天牛成蟲腸道細菌基因組D NA 的凝膠電泳圖譜Fig . 1The results of genom ic DNA extracti on fr omA priona ger m ari intestinal bacteria212正交組合優(yōu)化的桑天牛腸道細菌基因組DNA PCR 反應(yīng)體系從圖2可見, 不同組合的PCR 擴增結(jié)果存在一定的差異, 在這16個正交組合設(shè)計的PCR 反應(yīng)體系中, 組合1、6、16的擴增條帶最少或無, 組合11、12擴增出的條帶很暗而且模糊, 組合2、9、13所擴增的條帶稍亮但仍較模糊,

18、 組合3、4、5、7、8、14、15擴增條帶較亮; 而組合10的擴增帶最亮, 并且清晰整齊, 效果最好, 為最優(yōu)組合。因此確定PCR 最優(yōu)反應(yīng)體系(25L 為:10Buffer 215L, MgCl 2210mmol/L,d NTP 012mmol/L,隨機引物0148mol/L,Taq DNA 聚合酶0175U, 模板DNA 75ng 。213單因素優(yōu)化的PCR 反應(yīng)程序最佳退火溫度和循環(huán)次數(shù)從圖3顯示的PCR 反應(yīng)程序的退火溫度優(yōu)化試驗結(jié)果可見:58時擴增條帶較模糊; 60時擴增出的條帶清晰并且整齊, 擴增產(chǎn)物的量最大; 但隨著退火溫度的升高, 擴增產(chǎn)物的量變得不穩(wěn)定, 條帶也不清晰。從圖

19、4顯示的PCR 反應(yīng)程序的循環(huán)次數(shù)優(yōu)化試驗結(jié)果可見:25次循環(huán)擴增的產(chǎn)物量少, 條帶模糊; 30次循環(huán)擴增產(chǎn)物量多, 條帶清晰整齊; 循環(huán)次數(shù)增加到35次時擴增產(chǎn)物的量減少, 條帶出現(xiàn)模糊現(xiàn)象。基于上述試驗結(jié)果, 篩選出桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA PCR 最優(yōu)反應(yīng)程序為:952m in; 9430s ; 601m in, 724m in, 30個循環(huán); 7210m in。 M 為DL2000ladder 分子質(zhì)量標準; 泳道162M. DL2000ladder marker; Lanes 1t o 16are corres t 圖2D Fig . 2Electr the of m bact

20、eria fr om orthogonally designed experi ment M. DL2000ladder 分子質(zhì)量標準1-4. 退火溫度分別為58、60、63和65M. DL2000ladder marker1-4. Annealing te mperature of 58, 60, 63and 65res pectively圖3優(yōu)化退火溫度的PCR 結(jié)果Fig . 3The op ti m izati on results of annealing te mperaturein PCR reaction M. DL2000ladder 分子質(zhì)量標準1-3. 循環(huán)次數(shù)分別為25

21、、30和35次M. DL2000ladder marker 1-3. 25, 30and 35cycles res pectively圖4優(yōu)化循環(huán)次數(shù)的PCR 結(jié)果Fig . 4The op ti m izati on results of nu mber of a mp lificati oncycle in PCR reacti on3討論本試驗以微生物生態(tài)學(xué)為理論基礎(chǔ), 利用分子生物學(xué)技術(shù)對桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA 的提取方法進行了改良, 利用正交組合試驗和單因素梯度試驗對基因組DNA PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行了優(yōu)化, 試驗結(jié)果可為研究桑天牛腸道細菌多樣性和探索基于微生物生態(tài)

22、學(xué)的桑天牛防治新方法提供技術(shù)參考。基因組DNA 提取和PCR 擴增只是桑天牛腸道細菌多樣性研究的部分基礎(chǔ)試驗步驟, 進一步的研究仍需進行變性梯度凝膠電泳、DNA 測序、分析等大量后續(xù)試驗工作。本試驗對桑天牛成蟲腸道細菌基因組DNA 的提取參照郭冬生等9、吳紅萍等10的方法, 并針對桑天牛腸壁組織及蛋白等雜質(zhì)較多的特點, 對研磨、DNA 提純及RNA 去除等步驟加以改良, 主要有以下幾點:(1 用液氮進行快速冷凍研磨, 使研磨更充分并保證基因組DNA 不因高溫而降解; (2 用酚/氯仿/異戊醇溶液抽提時, 先用等體積的Tris 2平衡酚抽提23次, 然后用酚/氯仿/異戊醇溶液抽提1次, 最后再用

23、氯仿/異戊醇溶液抽提1次, 這樣有效去除了蛋白和腸道組織等雜質(zhì), 保證了DNA 具有較高的純度; (3 整個過程避免劇烈震蕩, 且在抽提時采用大口徑槍頭, 以保證DNA 的完整性; (4 由于每次提取都會出現(xiàn)大量RNA, 所以加大了RNase 的用量, 然后37水浴1h 以上, 有效去除了RNA 并使DNA 充分溶解。PCR 反應(yīng)體系中每一個因素的改變均對擴增條帶產(chǎn)生不同程度的影響:模板DNA 作為靶基因, 其用量與純度是PCR 成敗的關(guān)鍵因素之一; d NTP 和引物的量隨著反應(yīng)的進行會不斷減少; 底物d NTP 濃度過高會導(dǎo)致聚合酶錯誤的摻入, 濃度過低又會影響合成效率11; Taq DN

24、A 聚合酶活性是決定反應(yīng)成功與否的直接因素, 對擴增片段亮度有顯著影響, 要保持其活性需要一定的離子環(huán)境,Mg 2+濃度過高, 反應(yīng)特異性就會降低,Mg 2+濃度過低則會降低Taq DNA 聚合酶的活性, 從而影響反應(yīng)的產(chǎn)物量。PCR 反應(yīng)體系中各因素之間存在一個動態(tài)的適合濃度比例, 因此取得好的PCR 結(jié)果需要各個因素之間的相互優(yōu)化組合。本試驗對PCR 數(shù)進行了單因素優(yōu)化, 溫度是控制, 溫度過高或過低, 都會影響擴增效率。本試驗結(jié)果表明, 退火溫度在60時, 擴增效果最佳。由于循環(huán)次數(shù)的增加會造成非特異性產(chǎn)物的增加, 所以選定其它反應(yīng)參數(shù)以后再進行循環(huán)次數(shù)的摸索是比較合理的。循環(huán)次數(shù)在理論

25、上主要取決于模板DNA 的濃度, 2030個循環(huán)即可使PCR 產(chǎn)物量達到最大值。本試驗結(jié)果表明, 30個循環(huán)的擴增產(chǎn)量即可滿足本實驗進行后續(xù)研究的要求。參考文獻(References 1李會平, 黃大莊, 杜紹華, 等. 白僵菌經(jīng)不同基質(zhì)傳代后對桑天牛幼蟲的侵染力比較J .蠶業(yè)科學(xué), 2008, 34(2 :339-3412許平, 孫孝龍. 桑天牛發(fā)生規(guī)律與防治對策J .中國蠶業(yè),2007, 28(1 :24-263黃大莊, 劉輝芳. 桑天牛卵長尾嚙小蜂的繁殖生物學(xué)研究J .林業(yè)科學(xué), 2005, 41(2 :195-2014袁芳芳, 黃大莊, 王志剛, 等. 桑天牛卵嚙小蜂基因組DNA 的提

26、取及RAP D 反應(yīng)體系的優(yōu)化J .蠶業(yè)科學(xué), 2006, 32(4 :582-5855李會平, , 杜邵華, 等. J .農(nóng)藥學(xué), 2008, 10(2 221-J .中, 2003, 24(4 :30-317李繼泉, 楊元, 王樹香, 等. 桑天牛卵長尾嚙小蜂的寄主選擇定位行為J .昆蟲學(xué)報, 2007, 50(11 :1122-11288王曉紅, 紀惠芳, 黃大莊, 等. 桑天牛幼蟲感染白僵菌后的組織病理學(xué)研究J .蠶業(yè)科學(xué), 2008, 34(1 :18-239郭冬生, 孫亮先, 張巧利, 等. 一種高質(zhì)量蜂蜜核酸的快速提取方法J .泉州師范學(xué)院學(xué)報, 2005, 23(4 :85-8910吳紅萍, 鄭服叢. 不同環(huán)境中土壤微生物總DNA 的提取與純化J .廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),