由一株放線菌產(chǎn)生的對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶具有抑制作用的活性化合物的

1、由一株放線菌產(chǎn)生的對(duì)谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶具有抑制作用的活性化合物的 【摘要】 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-(GST-)的活性在某些類型的癌癥患者中有顯著的升高并且在癌癥細(xì)胞對(duì)抗癌藥物耐藥性的形成過程中起著重要的作用。抑制過量表達(dá)的GST-的酶活性將有助于克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，因此，GST-被認(rèn)為是一個(gè)潛在的藥物作用靶點(diǎn)。利用我所建立【摘要】 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-(GST-)的活性在某些類型的癌癥患者中有顯著的升高并且在癌癥細(xì)胞對(duì)抗癌藥物耐藥性的形成過程中起著重要的作用。抑制過量表達(dá)的GST-的酶活性將有助于克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，因此，GST-被認(rèn)為是一個(gè)潛在的藥物作用靶點(diǎn)。利用我所建立的GST-抑制劑高

2、通量篩選模型，在篩選針對(duì)GST-的新的抗癌藥物增敏劑的過程中，發(fā)現(xiàn)由一株放線菌550產(chǎn)生的發(fā)酵代謝產(chǎn)物對(duì)來源于人的GST-產(chǎn)生明顯的抑制活性。經(jīng)有機(jī)溶媒萃取、葡聚糖凝膠LH-20柱層析、HPLC制備等方法，從該菌的發(fā)酵液中分離到了一個(gè)對(duì)GST-有中等程度抑制活性的化合物550-a，其IC50為21.4g/ml，經(jīng)各種理化性質(zhì)及NMR分析確定該化合物與木黃酮(genistein)同質(zhì)，該化合物對(duì)GST-的酶抑制活性以前尚未見報(bào)道。 【關(guān)鍵詞】 谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶； 酶抑制劑； 木黃酮 ABSTRACT Glutathione S-transferase- (GST-) level usually i

3、ncreased apparently in sufferring from certain kinds of cancers, and it played an important role in the process of drug resistant tumor cells against anti-tumor agents. Inhibition of the overexpressed enzyme activity will contribute to overcome the resistance. Therefore, GST- has been considered as

4、a potential drug target for the cancer treatment. By using the GST- high throughput screening system model which was developed in our laboratory, an actinomycete strain No.550 has shown inhibitory activity to GST-. A compound named No.550-A was isolated from the mycelium, and by solvent extraction b

5、y Sephadex LH-20 column chromatography, and HPLC purification, the compound showed moderate activity against GST- with the IC50 of 21.4g/ml, by physico-chemical spectral analysis, the structure of the compound was identical with genistein, of which having inhibitory activity against GST- was firstly

6、 reported. KEY WORDS GST; Enzyme inhibitor; Genistein 谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，簡稱GST)為細(xì)胞內(nèi)存在的具有解毒作用的酶蛋白1，廣泛分布于動(dòng)、植物內(nèi)。GST作為一種具有多種生理功能的藥物代謝酶參與機(jī)體的解毒作用，可解除化學(xué)誘變劑、促癌劑等的毒性。GST催化還原型谷胱苷肽(glutathione，簡稱GSH)與親電子藥物(X)共價(jià)結(jié)合成GS-X復(fù)合物，再轉(zhuǎn)運(yùn)出體外而發(fā)揮解毒作用。 谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶具有多個(gè)亞型2，其中GST-是最重要的一種。研究表明，GST-的酶活性在多種類型腫瘤的患者體內(nèi)有異常

7、的升高，其水平與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)35，高活性的GST-可使腫瘤細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的耐藥性升高，導(dǎo)致化療失敗2。探討GST在腫瘤耐藥機(jī)制中的作用并以GST-為靶點(diǎn)尋找特異性的抑制劑，對(duì)提高臨床化療的敏感性、克服腫瘤的耐藥性將產(chǎn)生重要的意義6。 GST-的酶活性在多種腫瘤患者體內(nèi)有明顯增高，其水平與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)，兩者具有明顯的功能關(guān)系。我們以GST-為靶點(diǎn)，建立了一個(gè)GST抑制劑的高通量篩選模型，應(yīng)用此模型對(duì)從微生物來源的4800個(gè)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了篩選，在篩選過程中發(fā)現(xiàn)由一株放線菌550產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)來源于人的GST-產(chǎn)生明顯的抑制活性，本文報(bào)道對(duì)放線菌550所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究結(jié)果

8、。 1 材料與方法 1.1 材料 (1)主要試劑 人源(human placenta)谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-、底物1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2，4-dinitrobenzene，簡稱CDNB)和還原型谷胱苷肽(GSH)均購自Sigma公司；其余化學(xué)試劑均為分析純或色譜純?cè)噭?(2)主要儀器設(shè)備 Victor21420多功能測(cè)定儀(美國PE公司)，低溫離心濃縮儀(德國Christ公司)。 (3)菌株550的來源 放線菌550來源我國云南省。 1.2 方法 樣品對(duì)GST酶抑制率的計(jì)算公式為： 抑制率(%)=(A2-A1)對(duì)照孔-(A2-A1)樣品孔/(A2-A1)對(duì)照孔-(A2

9、-A1)空白孔100% 取抑制率大于50%的樣品為陽性樣品。 (2)菌株550的培養(yǎng) 于500ml的三角瓶中裝入100ml種子培養(yǎng)基(含2.4%淀粉；0.1%葡萄糖；0.3%蛋白胨；0.3%牛肉膏；0.5%酵母粉；0.4% CaCO3，pH7.0)。接種后于28培養(yǎng)3d，按10%的接種量將一級(jí)種子接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基(含4.0%可溶性淀粉；2.0%脫脂大豆粉；0.05% FeSO47H2O；0.05% K2HPO4；0.03% KCl，pH6.5)的三角瓶中，于28振搖培養(yǎng)14d。 從培養(yǎng)d5開始從發(fā)酵培養(yǎng)瓶中取出5ml樣品進(jìn)行經(jīng)時(shí)變化考察，共培養(yǎng)384h(16d)，每天取樣后加入兩

10、倍體積乙酸乙酯浸泡4h，3000r/min離心15min，取上清液濃縮至干，稀釋成一定體積，測(cè)定對(duì)GST抑制活性。 2 結(jié)果 2.1 菌株550發(fā)酵過程中產(chǎn)物活性的變化 菌株550發(fā)酵過程中產(chǎn)物活性的變化情況見Fig.1。菌株550的跟蹤培養(yǎng)，從d5開始每天取樣，測(cè)定發(fā)酵過程中培養(yǎng)液對(duì)GST的抑制率，并用HPLC檢測(cè)活性化合物的產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)在d14活性化合物產(chǎn)生量大，且活性達(dá)到高值，之后，活性未見明顯增加，故選擇發(fā)酵液活性最強(qiáng)的培養(yǎng)時(shí)間14d為發(fā)酵周期。 2.2 菌株550發(fā)酵液的提取 550發(fā)酵液3400ml，經(jīng)3000r/min離心15min，分別收集菌體與上清液，菌體用3000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用3000ml乙酸乙酯抽提二次，乙酸乙酯層加無水Na2SO