血液流變活性藥物的體外研究概況

1、    血液流變活性藥物的體外研究概況             作者：趙春景時(shí)間：2007-11-22 12:21:00                     藥物流變學(xué)是藥物學(xué)與流變學(xué)的交叉學(xué)科，旨在探索藥物發(fā)揮作用的流變學(xué)機(jī)制，本文

2、就藥物流變學(xué)研究的體外實(shí)驗(yàn)有關(guān)問(wèn)題作一總結(jié)。 臨床驗(yàn)證中的雙盲法安慰劑對(duì)照研究是流變活性藥物功效的最終試驗(yàn)，這些藥物的體外 實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)變得越來(lái)越主要，在尋找新藥之臨床前研究階段以及臨床研究階段，流變學(xué)實(shí) 驗(yàn)?zāi)軌蜓a(bǔ)充臨床結(jié)論。有關(guān)在臨床前和臨床試驗(yàn)階段對(duì)藥物進(jìn)行流變學(xué)體外實(shí)驗(yàn)的作用如下 。 臨床前試驗(yàn)階段：發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有藥物的新用途；確定化合物的流變學(xué)全貌(對(duì)RBC，WBC ，血小板，血漿蛋白的作用)；對(duì)流變活性藥物的同類(lèi)物進(jìn)行試驗(yàn)；尋找具有流變活性 的新化合物；在后繼的臨床試驗(yàn)中，確定合適的檢驗(yàn)藥物具有流變活性的方法。 臨床試驗(yàn)階段：提供一個(gè)客觀的結(jié)論；證明藥物在體內(nèi)的流變學(xué)作用；體現(xiàn)臨床 效果與

3、流變活性間的因果關(guān)系；發(fā)覺(jué)不敏感人群；確定量效關(guān)系和時(shí)間依賴(lài)性。 1體外實(shí)驗(yàn)的原則 在設(shè)計(jì)制定評(píng)價(jià)藥物臨床前和臨床研究的體外實(shí)驗(yàn)時(shí)必需遵循下列幾條基本原則。 1.1鑒定和分離靶細(xì)胞體 血液是一個(gè)混合的細(xì)胞群體，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞對(duì)象進(jìn)行適當(dāng)分離，流變活性藥物可能作 用于紅細(xì)胞，白細(xì)胞或血漿蛋白，亦或?qū)λ鼈兌加凶饔?，因而要求獲得較純的細(xì)胞群體，可 將全血經(jīng)棉花過(guò)濾獲得純的紅細(xì)胞，將全血經(jīng)過(guò)密度梯度沉降以獲得白細(xì)胞亞群，或通過(guò)低 速離心(400 g,5 min)獲得富含血小板的血漿。 1.2選擇合適的藥物濃度 很多藥物研究時(shí)使用了較高濃度而體內(nèi)不能達(dá)到如此高濃度，由于對(duì)到達(dá)靶細(xì)胞之藥物 精確濃度不甚清

4、楚，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)使用的藥物濃度應(yīng)覆蓋其發(fā)揮藥效的藥理學(xué)濃度范圍，如同 體外流變學(xué)試驗(yàn)所需合適細(xì)胞濃度一樣，藥物與細(xì)胞的比例也很重要，在體外使用的藥物濃 度應(yīng)盡量調(diào)至體內(nèi)藥物與細(xì)胞相應(yīng)的比例。 體外流變學(xué)研究時(shí)通常要將洗滌過(guò)的細(xì)胞懸浮在無(wú)蛋白質(zhì)的緩沖液中，與體內(nèi)富含蛋白 質(zhì)的血漿相對(duì)比，由于在體內(nèi)結(jié)合到血漿蛋白質(zhì)上的藥物相應(yīng)地被體外結(jié)合到靶細(xì)胞質(zhì)膜的藥物代替，因而到達(dá)靶細(xì)胞群藥物濃度較高。反之，如將白蛋白加入到緩沖液中，應(yīng)考慮 到結(jié)合在白蛋白上的藥物。緩沖液的特性也應(yīng)考慮。有些緩沖液如磷酸鹽和Tris能進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi)增加細(xì)胞的體積，因而影響流變測(cè)量。一些緩沖液不能穿透細(xì)胞，如HEPES，作為緩沖液

5、相對(duì)優(yōu)越些。 1.3流變儀器和方法的選擇 不同流變學(xué)測(cè)定儀器靈敏度差異很大。同一儀器的不同參數(shù)的靈敏性亦差異很大，因此 選擇使用儀器應(yīng)多注意。為了提高不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)量數(shù)據(jù)的可比性和結(jié)果的可靠性，應(yīng)盡可能 按照國(guó)際血液標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)關(guān)于血液流變學(xué)的規(guī)定和要求。 1.4亞群分離 血液不僅是由混合的細(xì)胞群體組成，而且不同的細(xì)胞群體還由復(fù)雜的亞群組成。紅細(xì)胞 按照其細(xì)胞陽(yáng)離子濃度和含水量由輕到重密切排列，基于細(xì)胞年齡和ATP含量發(fā)揮其酶的活 性。白細(xì)胞由處于不同成熟期的不同細(xì)胞系組成，其成熟狀態(tài)可以是靜態(tài)或激活的。同樣血 小板亞群依賴(lài)于其年齡和激活狀態(tài)而存在。 不同亞群之間存在著流變差異，針對(duì)相應(yīng)亞群流變

6、學(xué)測(cè)量的技術(shù)包括密度梯度分離，或 當(dāng)亞群在形態(tài)上可以識(shí)別時(shí)，如紅細(xì)胞內(nèi)含瘧原，可采用微吸管吮吸法1。用于 單個(gè)細(xì)胞流變測(cè)量的儀器如紅細(xì)胞剛性測(cè)量?jī)x，細(xì)胞轉(zhuǎn)移分析儀，已顯示了一定作用。 1.5質(zhì)量控制的要求 在臨床研究中對(duì)藥物流變參數(shù)的縱向研究必須嚴(yán)格實(shí)行質(zhì)量控制，用于質(zhì)量控制的流變 學(xué)方法仍處于初期，較簡(jiǎn)單的方法包括用正常樣本來(lái)檢測(cè)儀器的漂移情況， 或設(shè)對(duì)照組及有 效治療組。 1.6藥物對(duì)細(xì)胞膜和形態(tài)學(xué)的作用 親脂性藥物進(jìn)入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和流變學(xué)發(fā)生根本影響，根據(jù)脂雙層理論 這些藥物有時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，膨脹外層引起棘狀紅細(xì)胞癥，然后進(jìn)入內(nèi)層引起裂口紅細(xì)胞癥。 經(jīng)14C標(biāo)記可以確定藥物插

7、入脂質(zhì)雙層的程度2，能以此方式改變細(xì)胞形狀 的藥物，將對(duì)紅細(xì)胞的變形、聚集、沉降和粘滯產(chǎn)生不利影響。最顯著的例子就是血管擴(kuò)張 劑枸櫞酸西替帝爾(cetiedil)，在低濃度時(shí)改善紅細(xì)胞的變形性，而在高濃度時(shí)改變細(xì)胞膜 陽(yáng)離子流動(dòng)使細(xì)胞腫脹而失去變形能力3。 2其它試驗(yàn)是對(duì)流變學(xué)測(cè)量的補(bǔ)充 利用流變學(xué)試驗(yàn)在細(xì)胞水平證明藥物的影響是非常重要的，但是其敏感性和專(zhuān)一性很有 限，比如說(shuō)：阻止Ca2+流入和K+流出鐮刀狀紅細(xì)胞的陽(yáng)離子通道抑制劑能防止細(xì)胞 失水，研究其作用時(shí)可先將細(xì)胞脫水后，采用5 m孔徑的濾膜來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞膜變形性的 序貫下降3。更為敏感的方法是用同位素如45Ca、86Rb標(biāo)記， -閃爍

8、計(jì)數(shù)確定陽(yáng)離子流動(dòng)4，但使用流變學(xué)模型來(lái)證實(shí)其對(duì)完整細(xì)胞的作用 非常有用，兩種方法可看作是互相補(bǔ)充。 3采用動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?處于代謝靜止?fàn)顟B(tài)的靜態(tài)細(xì)胞不適合用來(lái)研究藥物的作用，采用適當(dāng)?shù)纳砗痛x動(dòng)力 模型可以增加流變學(xué)試驗(yàn)的敏感性和特異性。例如，對(duì)紅細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附力測(cè)量的試驗(yàn) 中采用的是生理應(yīng)力模型而不是靜態(tài)模型5。非離子表面活性劑6對(duì)此 模型有抑制作用。 抗鐮藥物的研究很困難，因?yàn)殓牭稜罴?xì)胞在其變形性、密度、年齡、膜性質(zhì)和形態(tài)諸方 面有很大的異質(zhì)性，然而采用密度梯度離心可以去除密度較大和不可逆的鐮狀細(xì)胞，剩下較 均勻的年輕細(xì)胞群體，體外在含鈣的緩沖液中，經(jīng)歷還原和氧化的循環(huán)，來(lái)模擬在體

9、內(nèi)循環(huán) 時(shí)的復(fù)雜過(guò)程。這些年輕細(xì)胞將發(fā)生進(jìn)行性的脫水，Ca2+通道抑制劑和鈣激活K+流 動(dòng)通道抑制劑，以及其它抗鐮藥物可用于研究對(duì)此模型中代謝應(yīng)力的保護(hù)作用。 采用循環(huán)氣體交換模擬體內(nèi)代謝因力，可以擴(kuò)展到局部貧血血管疾病，在那里循環(huán)的血 細(xì)胞暴露在低氧、低pH和/或高滲透壓的環(huán)境中，在此情形下存在著的交替改變非常復(fù)雜， 并具有時(shí)間依賴(lài)性。這是因?yàn)榫植控氀课坏牡蚿H按照Gibbs-Donnan效應(yīng)可引起細(xì)胞腫脹 ，隨后經(jīng)pH激活的KCl轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細(xì)胞K+丟失，細(xì)胞再次收縮7，局部貧血部位的 乳酸累積，由于滲透作用也引起細(xì)胞脫水。通過(guò)將正常紅細(xì)胞重復(fù)多次置于低氧、酸性和含 有不同藥物濃度的高滲透液

10、中，采用循環(huán)氣體交換可以驗(yàn)證藥物的預(yù)防作用。這種體外的試 驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵妊芗膊〉撵o脈血樣本接近病理，因?yàn)橐坏╇x開(kāi)局部貧血部位的代謝應(yīng)力環(huán)境， 而循環(huán)到靜脈抽血處，紅細(xì)胞迅速恢復(fù)正常代謝和流變狀態(tài)。 4不可預(yù)見(jiàn)性的藥物作用 藥物對(duì)血細(xì)胞流變學(xué)作用不可能總是能夠借助藥理文獻(xiàn)而預(yù)料，并由此在體外以合適模 型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。血管擴(kuò)張劑和鈣阻滯劑硝苯地平就是一個(gè)很好的例子，在興奮組織這個(gè)二氫吡 啶類(lèi)化合物能阻斷Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，它對(duì)循環(huán)血細(xì)胞作用尚未廣泛研究，除了能阻止Ca 2+流入紅細(xì)胞外，它還是一個(gè)作用很強(qiáng)的Ca2+激活的K+通道抑制劑4 。因此其作為抗鐮藥物的優(yōu)勢(shì)可能在于其血管擴(kuò)張作用，Ca2+進(jìn)入阻滯及

11、K+流 動(dòng)抑制作用之間的綜合，在局部貧血血管疾病，硝苯地平的流變學(xué)作用很復(fù)雜，除了對(duì)紅細(xì) 胞的作用外，對(duì)激活嗜中性白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附有著濃度依賴(lài)性的抑制作用 8。 總之，流變活性藥物的體外實(shí)驗(yàn)有著巨大的潛在優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)?zāi)芙忉屃髯儗W(xué)效應(yīng) 和藥物的作用。體外實(shí)驗(yàn)方法特別適合于一系列藥物濃度的研究和尋找活性化合物如中草藥 ，因其組成復(fù)雜，需經(jīng)分離以尋找有效的類(lèi)似物，在藥物試驗(yàn)的預(yù)試階段，流變 學(xué)方法研究 藥物對(duì)完整血細(xì)胞的功效非常優(yōu)越，而生化和同位素研究往往是針對(duì)破碎細(xì)胞。 在臨床試驗(yàn)中對(duì)體外獲得的血樣進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)確定臨床效果和流變學(xué)作用的關(guān)系很有價(jià)值 。另外流變學(xué)試驗(yàn)?zāi)苎a(bǔ)充臨床結(jié)論，

12、增加臨床試驗(yàn)的價(jià)值，提供簡(jiǎn)易方法用于先導(dǎo)性研究， 證明新試化合物的作用。流變學(xué)方法在解釋血管疾病的病理生理和確定合理有效藥物治療方 面具有優(yōu)越性。 參考文獻(xiàn) 1Nash G B, Obrien E, Gordon E C. Abnormalities in the mechanical flow properties of red blood cells caused by plasmodium falciparum. Blood,1989, 74(2):855 2Bilto Y Y, Ellory J C, Stuart J. Binding of oxpentifylline to the

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