蕎麥花葉總黃酮對(duì)大鼠急性壓力負(fù)荷c

1、    蕎麥花葉總黃酮對(duì)大鼠急性壓力負(fù)荷c            作者：姚文娟，韓淑英，宋會(huì)時(shí)間：2007-11-22 11:34:00                      【關(guān)鍵詞】  心肌肥厚  &#

2、160;  Effect of total flavones of buckwheat flower and leaf on cfos protein expression in course of acute pressure overload in rats【Abstract】 AIM: To explore the effect of total flavones of buckwheat flower and leaf (TFBFL) on the expression of cfos protein in the course of acute pressure overl

3、oad of the left ventricle in rats. METHODS: The rat models of myocardial hypertrophy caused by abdominal aortic banding were given ig TFBFL 0.1, 0.2 and 0.4 g/(kg/d）or captopril 60 mg/(kg/d） before operation. At 1, 3 and 12 h after operation,the expression of cfos was detected by immunohistochemistr

4、y following the sacrification of all rats. RESULTS: The expression of cfos in the left ventricular had a significant increase after 1 h of abdominal aortic banding and reached a peak at 3 h, decreased at 12 h. Compared with the models of myocardial hypertrophy, TFBFL 0.4, 0.2 and 0.1 g/(kg/d） reduce

5、d the expression of cfos by 21.41% (P<0.01), 14.52% (P<0.05) and 10.36% after 3 h of abdominal aortic banding. CONCLUSION: TFBFL can decrease the expression of cfos in the course of acute pressure overload of the left ventricle in rats.【Keywords】 myocardial hypertrophy; total flavones; pressur

6、e overload; buckwheat; cfos protein【摘要】 目的：觀察蕎麥花葉提取的總黃酮(TFBFL)對(duì)大鼠急性壓力負(fù)荷左心室cfos蛋白表達(dá)的影響. 方法：通過腹主動(dòng)脈狹窄建立心肌肥厚模型,術(shù)前給予TFBFL 0.1, 0.2和0.4 g/(kg/d)，卡托普利 60 mg/(kg/d）. 分別于狹窄后1，3和12 h處死動(dòng)物取材. 用免疫組化方法檢測(cè)左室心肌cfos蛋白的表達(dá). 結(jié)果：正常大鼠心肌沒有或僅有少量cfos表達(dá)，腹主動(dòng)脈狹窄后1 h, cfos表達(dá)明顯增加，3 h達(dá)高峰，較對(duì)照組升高約3倍，12 h開始下降. 腹主動(dòng)脈狹窄后3 h, TFBFL 0.4,

7、0.2和0.1 g/(kg/d）與心肌肥厚組相比, cfos表達(dá)分別降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<0.05)和10.36%. 結(jié)論：TFBFL可明顯降低cfos蛋白的表達(dá).【關(guān)鍵詞】 心肌肥厚; 總黃酮; 壓力負(fù)荷; 蕎麥; cfos蛋白0引言心肌肥厚是多種心血管疾病的共同病理過程，也是心衰的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為心肌重構(gòu)、心臟的順應(yīng)性和循環(huán)泵功能降低. 關(guān)于心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制至今還沒有一個(gè)明確的結(jié)論，多年來一直是心血管疾病研究的熱點(diǎn). 蕎麥花葉總黃酮(total flavones of buckwheat flower and leaf,TFBFL)是從蓼科植

8、物甜蕎麥花葉中提取的活性成分. 華北煤炭醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室前期研究發(fā)現(xiàn)TFBFL具有抗氧化和影響血管活性及對(duì)心肌肥厚具有保護(hù)等作用1-3. 為探討TFBFL對(duì)心肌肥厚的影響及作用機(jī)制,我們采用大鼠腹主動(dòng)脈狹窄建立心肌肥厚模型，旨在觀察TFBFL對(duì)左心室cfos蛋白表達(dá)的影響及其可能機(jī)制.1材料和方法1.1材料蕎麥花葉(來自內(nèi)蒙古庫倫旗)為秋冬季因霜凍未結(jié)果而自然干燥的甜蕎麥花葉. 用10倍量700 /乙醇回流提取3次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇并濃縮原液量的1/2，提取液趁熱過濾去除不溶性沉淀，加分離劑冷卻析出淡黃色結(jié)晶，離心，沉淀物經(jīng)70烤干即為TFBFL. 經(jīng)中國(guó)科學(xué)院藥物研究所鑒定

9、為黃酮類，TFBFL含量為980 /. 一抗為多克隆兔抗鼠cfos抗體，SP免疫組化試劑盒(均購自美國(guó)Santa cruz公司). MP200型電子天平(上海第二天平儀器廠). SD大鼠108只，雄性，體質(zhì)量(200±20) ，由北京中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，合格證號(hào)SCXK 11 01 0006.1.2方法1.2.1大鼠心肌肥厚模型建立大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/kg)后，行腹部正中切口，在雙側(cè)腎動(dòng)脈上方游離一段腹主動(dòng)脈，沿腹主動(dòng)脈平行置一直徑為0.7 mm的小圓棒(7號(hào)針頭磨制)，用0號(hào)絲線繞腹主動(dòng)脈和小圓棒一起結(jié)扎，隨后抽出小圓棒，則使腹主動(dòng)脈部分狹

10、窄. 假手術(shù)組除不用絲線結(jié)扎外，其余操作步驟相同.1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組取心電圖(ECG)正常的健康大鼠108只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組，肥厚模型組，TFBFL高、中和低劑量干預(yù)組及陽性藥物卡托普利對(duì)照組，每組動(dòng)物再隨機(jī)分為1，3和12 h，3個(gè)時(shí)間點(diǎn). TFBFL干預(yù)組于術(shù)前分別給予0.4, 0.2和0.1 g/(kg/d）灌胃（ig），卡托普利組ig 60 mg/(kg/d)共3 d. 末次給藥后2 h進(jìn)行手術(shù).1.3檢測(cè)指標(biāo)取左心室心尖部組織用40 g/L甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片. 切片脫蠟至水，0.3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后,100 /正常山羊血

11、清封閉非特異性抗原，滴加一抗(1100稀釋，兔抗鼠多克隆抗體) 4過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗，37孵育30 min；滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片. 以PBS代替一抗作陰性對(duì)照. 應(yīng)用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行圖像分析，結(jié)果用積分光密度值表示，間接反映cfos蛋白的相對(duì)含量.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用計(jì)算機(jī)instat軟件處理,所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組間差別采用方差分析檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果21cfos蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程正常大鼠左心室肌僅有少量cfos陽性細(xì)胞表達(dá), 陽性細(xì)胞

12、胞核著棕黃色（圖1A）. 壓力超負(fù)荷后不同時(shí)間點(diǎn)cfos陽性細(xì)胞不同程度地表達(dá)(表1),陰性對(duì)照組未見cfos陽性細(xì)胞表達(dá)（圖1B）,由表1可見腹主動(dòng)脈狹窄后1 h大鼠左心室cfos表達(dá)明顯升高，3 h達(dá)高峰（圖1C），較對(duì)照組升高約3倍，12 h已經(jīng)開始下降.22TFBFL對(duì)cfos蛋白表達(dá)的影響由表1及圖1D可見陽性藥物卡托普利可明顯抑制cfos的表達(dá)，TFBFL可抑制左心室cfos的表達(dá),高劑量?jī)?yōu)于中低劑量（圖1EF）. 以腹主動(dòng)脈狹窄后3 h大鼠左心室cfos表達(dá)為例，TFBFL高、中、低劑量與心肌肥厚組相比,積分光密度分別降低21.41%(P<0.01)，14.52%(P<

13、;0.05)和10.36%.A: 假手術(shù)組3 h cfos的表達(dá) ×400; B: 陰性對(duì)照組cfos的表達(dá) ×400; C: 肥厚組3 h cfos的表達(dá) ×400; D: 卡托普利組3 h cfos的表達(dá) ×400; E: TFBFL高劑量組3 h cfos的表達(dá) ×400;  F: TFBFL中劑量組3 h cfos的表達(dá) ×400.圖1心肌cfos蛋白免疫組化染色（略）表1TFBFL對(duì)cfos蛋白表達(dá)的影響（積分光密度值）（略）bP<0.01 vs假手術(shù)組; cP<0.05, dP<0.01 vs肥

14、厚模型組.3討論本實(shí)驗(yàn)通過部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈的方法造成大鼠急性壓力負(fù)荷心肌肥厚模型，觀察cfos蛋白表達(dá)情況，并用藥物TFBFL進(jìn)行干預(yù). 結(jié)果顯示陽性藥物卡托普利可明顯抑制cfos的表達(dá), 與文獻(xiàn)報(bào)道4結(jié)果一致，說明動(dòng)物模型復(fù)制成功，同時(shí)得出TFBFL對(duì)急性壓力負(fù)荷心肌肥厚早期cfos表達(dá)有明顯的抑制作用，并有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系. Cfos是立即早期基因之一，壓力負(fù)荷cfos表達(dá)增加的直接刺激因素主要可能是由于腹主動(dòng)脈狹窄后血壓升高，對(duì)心肌的機(jī)械牽張?jiān)鰪?qiáng). 有研究表明5，心肌細(xì)胞牽張刺激可直接增加心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成. 其次也與繼發(fā)性腎血流量減少，使腎素血管緊張素系統(tǒng)激活，Ang分泌增加，以及

15、應(yīng)激、壓力感受器興奮使交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增強(qiáng)，兒茶酚胺含量增高等神經(jīng)、體液因素有關(guān). Cfos的核內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子，后者可作用于次級(jí)反應(yīng)基因（如肌肉收縮蛋白基因等）5端的一些調(diào)控序列，改變與心肌肥厚有關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，從而導(dǎo)致心肌組織中蛋白合成增加，蛋白表型向胚胎型轉(zhuǎn)化等心肌肥厚特征性變化. 因此TFBFL可能通過降低原癌基因cfos從而抑制心肌肥厚. 黃酮類化合物主要成分之一槲皮素對(duì)心肌肥厚有一定的逆轉(zhuǎn)作用，秦泰春等采用不同方法復(fù)制心肌肥厚動(dòng)物模型，給予槲皮素后, 心肌Ca2+與動(dòng)脈Ca2+含量下降， SOD活性增加,使心肌肥厚受到抑制. 同時(shí)秦泰春等6從細(xì)胞水平證實(shí)槲皮素可抑制血管

16、緊張素致培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞肥大，該作用與抑制蛋白激酶C及酪氨酸蛋白激酶活性有關(guān). 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)TFBFL具有抑制肥厚心肌Ang生成的作用2，故推測(cè)TFBFL或其中某些成分通過抑制原癌基因cfos表達(dá)從而抑制心肌肥厚，也可能是通過調(diào)節(jié)ACE或Ca2+來影響cfos的表達(dá)的，其確切機(jī)制我們將進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1 韓淑英,呂華,朱麗莎,等.蕎麥種子總黃酮降血脂、血糖及抗脂質(zhì)過氧化作用的研究J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2001,17(6):694-696.2 韓淑英,張軍,王志路，等.蕎麥花總黃酮對(duì)大鼠心肌肥厚的保護(hù)作用J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(14)：1338-1340.3 劉淑梅,韓淑英,崔國(guó)金,等.甜蕎麥葉總黃