重組AAV2包裝protocol

1、試劑：1. 1 X HBS : (20mM HEPES,150mM NaCI, PH=7.4)Hepes 分子量 238.31NaCI 58.440.954g Hepes1.754g NacI 溶于200ml去離子水，調(diào)節(jié) PH 7.4過濾除菌2. 50mM PEI+150mM NaCI過濾除菌PEI單體分子量430.043g PEI 0.1753g NaCl定容至20ml，過濾除菌，不用調(diào) PH一、簡易步驟制備DNA/PEI混合物：（用于150mm培養(yǎng)皿包裝）1. 取 pTR 17.5ug ; pAAV-RC 17.5ug ; pHelper 28ug 加入一個 15ml 離心管，用 1X

2、HBS 補 至1ml，混勻后室溫靜置 10min。2. 取PEI 56.7ul （N/P=15）加入另一個 15ml離心管，用1 X HBS補至1ml，混勻后室溫靜 置 10min。3. 吸取上述PEI溶液逐滴加入DNA混合液中，混勻后室溫靜置10min （順序不要顛倒）。轉染：4. 取培養(yǎng)在150mm盤中的AAV-293細胞，細胞密度 70%-80%。5. 吸凈培養(yǎng)液（AAV-293細胞貼壁不牢，可不用PBS洗）。6. 取上述制備好的 DNA/PEI混合物，逐滴均勻的加在裸露的單層細胞上，輕輕傾斜培養(yǎng)皿，使液體鋪均勻。7. 補加10%血清的DMEM，輕輕的搖晃均勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72小時

3、，期間培養(yǎng)液變 黃后補加5ml左右培養(yǎng)基，不黃可不用補液。（補加培養(yǎng)基時應將巴斯管頭或槍頭貼在培養(yǎng)皿內(nèi)壁上，使培養(yǎng)基貼壁緩慢流入培養(yǎng)皿，避免噴射沖刷細胞，尤其用巴斯管操作時）收毒8. 72小時后，取培養(yǎng)皿吸凈培養(yǎng)基。加1mlPBS，用細胞刮刀將細胞刮至培養(yǎng)皿的一邊，吸至1.5ml離心管中。9. 將離心管置于液氮中凍結5min，拿出后于37C水浴鍋中搖晃融化，期間用震蕩器反復震 蕩幾次。10. 重復凍融3次，觀察細胞破碎呈絮狀和團塊。11.4000rpm/min離心10min，轉移上清到新的離心管，-80凍存或進行純化步驟。、詳細步驟 制備DNA/PEI混合物：1. 計算質粒和PEI（50mM）

4、用量：三質粒等摩爾比 ，PEI為N/P=15情況下用量150mm 板：17.5ug17.5ug28 ug56.7ul(N/P=15)pTRpAA V-RC pHelperPEI按質粒濃度算出體積，15cm板質?？傎|量為63卩g, PEI（50mM）為56.7ul,用不同規(guī)格培養(yǎng)皿時可按培養(yǎng)面積相應改變，附主要培養(yǎng)皿面積表。培養(yǎng)器皿面積（cm2）培養(yǎng)液量（ml）細胞量6 cm培養(yǎng)皿215.05.2 X0610 cm培養(yǎng)皿5510.0613.7 X025cm培養(yǎng)瓶255.05X10675cm2培養(yǎng)瓶7515 302 X10715cm培養(yǎng)皿14830-45N/P比為PEI中N （胺基氮）與核算中 P

5、 （磷酸基）摩爾比，PEI用量與DNA質量、PEI濃 度和N/P有關，PEI用量計算公式為：PEI（卩 l/well）= （3nmol P x gDNA） R_50nmol N/ 卩 l其中3nmol P為每ugDNA 中所含 P, x為總DNA 質量，R為N/P比，50nmol N/ul為PEI 濃度（即50mmol/l, PEI濃度是指其單體乙烯亞胺的濃度）N/P在10-20之間對 AAV-293都有不錯的轉染效率。2. 取兩個EP管，將算好的質粒加到一個EP管里，用1 X HBS補至1ml，混勻后室溫靜置10min。將相應的PEI加到另一個管里，用1 X HBS補至1ml，混勻后室溫靜置

6、 10min 。PEI很難溶于150mM NaCI中，需加熱至40 C左右持續(xù)攪拌才能完全溶解，放于4 C不久又會變渾濁，用 150mM NaCI溶解的PEI從-20 C拿出后需在37 C水浴中加熱搖 晃使其變清澈，用乙醇溶解的PEI似乎沒有這個問題。3. 將上述PEI溶液逐滴加入 DNA混合液中，混合均勻后室溫靜置10min。陽離子聚合物轉染試劑的使用似乎都是將試劑加入到DNA混合物中，雖然混合順序對PEI轉染結果沒有明顯影響，但我們也還是按這個順序來做。4. 取培養(yǎng)在15cm盤的細胞，吸凈培養(yǎng)基，將上述制備好的DNA/PEI混合物，逐滴均勻的加在裸露的單層細胞上，輕輕傾斜培養(yǎng)皿，使液體鋪均

7、勻。細胞密度為70%-80%最好，因為繼續(xù)培養(yǎng)的 72小時細胞還會增殖，太密會影響外源基 因表達。AAV-293生長速度比293慢，應在轉染前24-48小時前就鋪板，觀察細胞密度適宜時再 轉染。一般培養(yǎng)在 75cm2的培養(yǎng)瓶中80%密度的細胞可傳1個15cm大盤。AAV-293貼壁不牢，吸凈培養(yǎng)基后可不用PBS洗。加入DNA/PEI混合物后，不要為了平鋪液體而大幅度傾斜培養(yǎng)皿，這樣會因為液體的 沖刷而使貼壁不牢的單個細胞脫落。5.補加10%血清的DMEM 20ml，輕輕的搖晃均勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72小時，期間培養(yǎng)液變黃后適當補加培養(yǎng)基，不黃可不用補液。補加培養(yǎng)基時應將巴斯管頭或槍頭貼在培養(yǎng)

8、皿內(nèi)壁上，使培養(yǎng)基貼壁緩慢流入培養(yǎng)皿, 避免噴射沖刷細胞，尤其用巴斯管操作時。24小時候可觀察熒光，隨時間增加外源基因表達會越來越強，至收毒前仍然有很強的 熒光。48h左右培養(yǎng)液會不同程度變黃，這時視情況補加5ml左右培養(yǎng)基。6.72小時后，取培養(yǎng)皿棄培養(yǎng)基。加ImlPBS，用細胞刮刀將細胞刮至培養(yǎng)皿的一邊，吸至1.5ml EP管中。收毒前觀察細胞病例改變，應有泡狀隆起，部分細胞變圓、脫落、漂浮，AAV-293有泡狀隆起的占大多數(shù)，脫落漂浮的細胞很少。7.將離心管置于液氮中凍結 5min，拿出后于37C水浴鍋中搖晃融化，期間用震蕩器反復震 蕩幾次。重復凍融 3次，觀察細胞破碎呈絮狀和團塊，裂解

9、液略微粘稠。在液氮凍結的時候用繩子系住離心管，然后緩慢放入液氮中，蓋上蓋子。也可在-80 C凍結，時間延長到10min。融化過程中應不時在震蕩器上震，以使細胞完全裂解。8.4000rpm/min離心10min，轉移上清到新的離心管，-80凍存或進行純化步驟。三、粗純化1將收集的培養(yǎng)物定義為初始物加入1/10體積的氯仿，置于37搖床中劇烈振搖1 h2. 加入固體氯化鈉至終濃度1 mol/L,振搖溶解.4C , 12 000 r/min離心15 min.取出上層水相，棄去氯仿和沉淀.3. 加PEG8000至終濃度10% (w/v), 振搖溶解后冰浴放置 1 h, 11 000 r/min離心15 min.將上清棄去，用適當PBS緩沖液將各離心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脫下來合并，將其分裝至1.5 mL塑料離心管中，此時的 rAAV定義為中間產(chǎn)物.4. 加入DN