PCR技術原理PPT課件

1、2021/3/91變性與復性變性與復性PCR原理原理2021/3/92 DNA的變性(denaturation)： 在某些理化因素作用下，DNA分子內堿基對之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結構變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團樣結構的過程。2021/3/94解鏈溫度（融解溫度，Tm）(melting temperature)：使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈是在一個相當窄的溫度內完成的。增色效應：增色效應： DNA變性后對變性后對260nm紫外光收紫外光收增加的現象。增加的現象。2021/3/97DNA的復性（的復性（renaturation)： 在適當條件下，變

2、性在適當條件下，變性DNA的兩條的兩條互補鏈可再恢復成天然的雙螺旋結互補鏈可再恢復成天然的雙螺旋結構的過程。構的過程。熱變性的熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱為性，此過程稱為退火退火(annealing)。減色效應減色效應：變性變性DNA復性后復性后對對260nm紫外光紫外光吸收減少的現象吸收減少的現象。2021/3/9101. 常用的變性方法：常用的變性方法： 熱變性熱變性 酸堿變性酸堿變性 化學試劑變性化學試劑變性 Tm值的估算值的估算 20bp Tm=69.3+0.41(G+C)% Tm=81.5+16.6lgM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（

3、甲酰胺（甲酰胺%） 2021/3/912PCRPCR技術總論技術總論 聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內大量擴增特定的片段的分子生物學技術。 聚合酶鏈式反應也可以當作一項極其重要的酶促合成DNA技術。PCR又稱為無細胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術的一次重大革新，它可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）兩家研究室分別用改進的Kleppe法獲得了大量染色體DNA單拷貝基因。當時的PCR技術須在每次變性和退

4、火后，擴增反應前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系統(tǒng)引入了熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶，這是從水生棲熱菌（Thermusaquaticus）中提取的耐熱DNA聚合酶，簡稱Taq DNA聚合酶。多次循環(huán)后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反應體系自動往復多次地進行對所需的DNA的片段的酶促合成，使反應產物按指數增長，所以命名為聚合酶鏈式反應。PCRPCR基本原理基本原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94下解鏈; (2

5、) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension): DNA模板引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。 到達平臺期所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。 。2021/3/916PCRPCR原理原理Sample den

6、aturatationPrimer annealingPrimer extension2021/3/917PCR productPCR product2021/3/918PCR反應曲線反應曲線2021/3/919標準的標準的PCRPCR反應體系反應體系 10擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul2021/3/920PCRPCR反應五要素反應五要素引物（引物（primer） 酶酶 （T

7、aq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板模板 （template） Mg2+ （magnesium）2021/3/921引物引物 引物是引物是PCR特異性反應的關鍵特異性反應的關鍵 PCR 產物的特異性取決于引物與模板產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度互補的程度 理論上，只要知道任何一段模板理論上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用引物，用 PCR就可將模板就可將模板DNA在體外大在體外大量擴增量擴增2021/3/922引物設計的原則（一）引物設計的原則（一

8、）引物長度：引物長度： 15-30bp，常用為，常用為20mer左右左右 引物的有效長度不能大于引物的有效長度不能大于 38 mer，否則最適延伸，否則最適延伸溫度會超過溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（聚合酶的最適溫度（74），），不能保證不能保證PCR擴增產物的特異性擴增產物的特異性引物擴增跨度：引物擴增跨度：以以500bp為宜為宜 特定條件下可擴增長至特定條件下可擴增長至10kb的片段的片段引物堿基：引物堿基：G+C含量以含量以40-60%為宜為宜 G+C太少擴增效果不佳，太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異過多易出現非特異條帶條帶 ATGC最好隨機分布，避免最好隨機分布，避

9、免5個以上的嘌呤或嘧啶個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列核苷酸的成串排列2021/3/923引物設計的原則（二）引物設計的原則（二）避免引物內部出現二級結構避免引物內部出現二級結構 避免兩條引物間互補，避免兩條引物間互補， 特別是特別是 3端的互補，否端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶則會形成引物二聚體，產生非特異性的擴增條帶引物引物 3端的堿基要求嚴格配對端的堿基要求嚴格配對 特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端特別是最末及倒數第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致堿基不配對而導致PCR失敗失敗引物中有或能加上合適的酶切位點引物中有或能加上合適的酶切位點 被擴增的靶

10、序列最好有適宜的酶切位點，這對酶被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處切分析或分子克隆很有好處2021/3/924引物設計的原則（三）引物設計的原則（三）引物的特異性：引物的特異性： 引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性源性引物量：引物量： 每條引物的濃度每條引物的濃度0.1 1umol或或10 100 pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好以最低引物量產生所需要的結果為好 引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會可增加引物之間形成二聚體的機會2

11、021/3/925引物設計的原則（四）引物設計的原則（四） RT-PCR 引物設計特別注意：引物設計特別注意： 跨越兩個外顯子跨越兩個外顯子2021/3/926酶及其濃度酶及其濃度 目前有兩種目前有兩種 Taq DNA 聚合酶供應聚合酶供應 天然酶：從棲熱水生桿菌中提純天然酶：從棲熱水生桿菌中提純 基因工程酶：大腸菌合成基因工程酶：大腸菌合成 一個典型的一個典型的 PCR反應約需酶量反應約需酶量 2.5U（指總（指總反應體積為反應體積為100 ul時）時） 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少合成產物量減少2021/3/927dNTP 的質

12、量與濃度的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和的質量與濃度和 PCR擴增效率有密切擴增效率有密切關系關系 dNTP呈顆粒狀，呈顆粒狀， 保存不當易變性失活保存不當易變性失活 dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或或1M Tris-HCl的緩沖液將其的緩沖液將其pH調節(jié)到調節(jié)到7.07.5，小量分裝，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融冰凍保存。多次凍融會使會使dNTP降解降解 在在PCR反應中，反應中，dNTP應為應為50200umol/L，尤其，尤其是注意是注意4種種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制的濃度要相等（等摩爾配制 ），）， 如其

13、中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量產物的產量 dNTP 能與能與Mg2+結合，使游離的結合，使游離的Mg2+濃度降低濃度降低2021/3/928模板（靶基因，模板（靶基因，target genetarget gene） 模板核酸的量與純化程度，是模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一的關鍵環(huán)節(jié)之一 傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用純化方法通常采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K 來消化處理標本來消化處理標本 SDS 的主要功能是：溶解細胞膜

14、上的脂類與蛋白的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀還能與蛋白質結合而沉淀 蛋白酶蛋白酶K 能水解消化蛋白質，特別是與能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合結合的組蛋白的組蛋白, 再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸2021/3/929模板（靶基因，模板（靶基因，target genetarget gene） 提取的核酸即可作為模板用于提取的核酸即可作為模板

15、用于PCR反應反應 一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增擴增 RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止法，要防止RNase降解降解RNA2021/3/930MgMg2+2+濃度濃度 Mg2+對對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影擴增的特異性和產量有顯著的影響響 在一般的在一般的 PCR反應中，各種反應中，各種NTP濃度為濃度為200umol/L時，時，Mg2+濃度為濃度

16、為1.52.0 mmol/L為宜為宜 Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，異擴增， 濃度過低會降低濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶聚合酶的活性，使反應產物減少的活性，使反應產物減少2021/3/931PCRPCR反應條件的選擇反應條件的選擇 PCR反應條件反應條件: 溫度溫度 時間時間 循環(huán)次數循環(huán)次數2021/3/932溫度與時間的設置溫度與時間的設置： 設置變性設置變性-退火退火-延伸三個溫度點延伸三個溫度點 標準反應中采用三溫度點法，雙鏈標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在在9095變性，再迅速冷卻至變性，再迅速冷卻至40 60，引物

17、退火并結合到靶序列上，然后快速升溫引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至至7075，在，在Taq DNA 聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸使引物鏈沿模板延伸 對于較短靶基因（長度為對于較短靶基因（長度為100300bp時）時）可采用二溫度點法，可采用二溫度點法， 將退火與延伸溫度合將退火與延伸溫度合二為一，一般采用二為一，一般采用94變性，變性，65左右退火左右退火與延伸與延伸2021/3/933 變性溫度與時間：變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全是導致變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗失敗的最主要原因的最主要原因 一般一般9394lmin足以使模板足以使模板DN

18、A變性變性 若低于若低于93則需延長時間則需延長時間 但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。影響。 此步若不能使靶基因模板或此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全產物完全變性，就會導致變性，就會導致PCR失敗失敗2021/3/934 退火退火( (復性復性) )溫度與時間：溫度與時間： 退火溫度是影響退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素特異性的較重要因素 變性后溫度快速冷卻至變性后溫度快速冷卻至4060，可使引，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會復雜得多，引物和模

19、板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度組成及其濃度，還有靶基序列的長度 對于對于20個核苷酸，個核苷酸，G+C含量約含量約50%的引物，的引物，55為選擇最適退火溫度的起點較為理想為選擇最適退火溫度的起點較為理想2021/3/935引物的復性溫度引物的復性溫度通過以下公式幫助選擇合適的溫度：通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm值（解鏈溫度）值（解鏈溫度）=4（G+C）2（A+T） 復性溫度復性溫度=Tm值值-（510） 在在Tm值允許范圍內，選擇

20、較高的復性溫度可值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性反應的特異性 復性時間一般為復性時間一般為3060sec，足以使引物與，足以使引物與模板之間完全結合模板之間完全結合2021/3/936 延伸溫度與時間：延伸溫度與時間： Taq DNA聚合酶的生物學活性：聚合酶的生物學活性： 7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 高于高于90時，時，DNA合成幾乎不能進行合成幾乎不能進行2021/3/937 延伸溫度與時

21、間：延伸溫度與時間： 延伸溫度：一般選擇在延伸溫度：一般選擇在7075之間之間 常用溫度為常用溫度為72 過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。 延伸反應時間：根據待擴增片段長度而定延伸反應時間：根據待擴增片段長度而定 1Kb以內的以內的DNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min（足夠）（足夠） 34kb的靶序列需的靶序列需34min 擴增擴增10Kb需延伸至需延伸至15min 延伸進間過長會導致非特異性擴增延伸進間過長會導致非特異性擴增 對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些2021/3/938循環(huán)次數循環(huán)次數 循環(huán)次數

22、循環(huán)次數 決定決定PCR擴增程度擴增程度 循環(huán)次數循環(huán)次數 主要取決于模板主要取決于模板DNA的濃度的濃度 循環(huán)次數：選在循環(huán)次數：選在3040次之間次之間 循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之循環(huán)次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多增多2021/3/939PCRPCR反應特點反應特點特異性強特異性強靈敏度高靈敏度高簡便、快速簡便、快速對標本的純度要求低對標本的純度要求低2021/3/940特異性強特異性強 關鍵：引物與模板的正確結合關鍵：引物與模板的正確結合 引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的基配對原則的 合成反應的忠實性及合成反應的忠實

23、性及Taq DNA聚合酶耐高溫聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高靶基因區(qū)，其特異性程度就更高2021/3/941PCRPCR反應的特異性決定因素反應的特異性決定因素 引物與模板引物與模板DNA特異正確的結合；特異正確的結合； 堿基配對原則；堿基配對原則； Taq DNA聚合酶合成反應的忠實

24、性；聚合酶合成反應的忠實性； 靶基因的特異性與保守性靶基因的特異性與保守性2021/3/942靈敏度高靈敏度高 PCR 產物的生成量是以指數方式增加產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克的，能將皮克 ( pg=10-12 ) 量級的起始待量級的起始待測模板擴增到微克測模板擴增到微克( ug=10-6)水平水平 從從 100 萬個細胞中檢出一個靶細胞萬個細胞中檢出一個靶細胞 在病毒的檢測中，在病毒的檢測中，PCR 的靈敏度可達的靈敏度可達 3 個個RFU (空斑形成單位空斑形成單位) 在細菌學中最小檢出率為在細菌學中最小檢出率為3個細菌個細菌2021/3/943簡便、快速簡便、快速 PCR反應

25、用耐高溫的反應用耐高溫的 Taq DNA聚合酶，一聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在次性地將反應液加好后，即在DNA 擴增液擴增液和水浴鍋上進行變性和水浴鍋上進行變性-退火退火-延伸反應，一般延伸反應，一般在在24 小時完成擴增反應。擴增產物一般用小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣染、易推廣2021/3/944對標本的純度要求低對標本的純度要求低 不需分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，不需分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及總粗制品及總 RNA 均可作為擴增均可作為擴增模板模板 可直接用臨床標本如血液、體腔液、

26、可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的的DNA擴增檢測擴增檢測2021/3/945q熱啟動PCRqTouch-down PCRqRT-PCRq兼并引物PCRq巢氏PCRq反向PCRq不對稱PCRq原位PCRq連接酶鏈反應qRACE-PCRqAFLPq免疫-PCR(immuno-PCR)qMSP甲基化特異PCR2021/3/946目的：擴增產生特異長度的單鏈目的：擴增產生特異長度的單鏈DNADNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物引物和非限制性引物, ,其最佳比

27、例一般是其最佳比例一般是0.010.5M,0.010.5M,關鍵是限制性引物的絕對量。關鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針；用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針； 基因組基因組DNADNA結構功能的研究結構功能的研究2021/3/947 2021/3/948用反向的互補引物來擴增兩引物以外的用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNADNA片段，片段，對某個已知對某個已知DNADNA片段兩側的未知序列進行擴增。片段兩側的未知序列進行擴增。2021/3/9492021/3/950用于檢測特定基因序列的存在或缺失。用于檢測特定基因序列的存在或缺失。2021/3/

28、951123412342021/3/952 利用同位素、熒光素等對引物進行標記利用同位素、熒光素等對引物進行標記, , 用以直觀地檢測目的基因。用以直觀地檢測目的基因。 特別適合大量臨床標本的基因診斷特別適合大量臨床標本的基因診斷 可同時檢測多種基因成分可同時檢測多種基因成分2021/3/9532021/3/954 錨定錨定PCRPCR首先合成第一鏈首先合成第一鏈cDNA,cDNA,然后再添加一同然后再添加一同聚物尾（聚物尾（polydG),polydG),與同聚物尾配對的與同聚物尾配對的33錨定引物（錨定引物（帶有限制性內切位點帶有限制性內切位點polydC)polydC)一起作一起作PCR

29、PCR擴增擴增2021/3/9552021/3/956可用于基因芯片的制作可用于基因芯片的制作2021/3/957 原位聚合酶鏈式反應（原位聚合酶鏈式反應（In Still PCR,IsIn Still PCR,IsPCRPCR）是由是由HaaseHaase等于等于19901990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段一個微小的反應體系來擴增細胞內的目的片段, ,在不破在不破壞細胞的前提下壞細胞的前提下, ,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內的擴增產物。內的擴增產物。 直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片

30、在單個細胞中直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行擴增?？蛇M行細胞內定位和檢測病理切片進行擴增。可進行細胞內定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。中含量較少的靶序列。2021/3/958操作步驟操作步驟1. 1. 細胞或組織固定：細胞經固定和乙醇通透化處理后便細胞或組織固定：細胞經固定和乙醇通透化處理后便適于一般適于一般PCRPCR試劑（包括引物和試劑（包括引物和TaqTaq酶）進入酶）進入2. PCR2. PCR擴增細胞內目的片段擴增細胞內目的片段3. 3. 原位雜交檢測擴增產物原位雜交檢測擴增產物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達2021/3/959逆轉錄酶逆轉錄酶

31、聚合酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCRPCR擴增擴增2021/3/960 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針, ,對對PCRPCR產物進行標產物進行標 記跟蹤記跟蹤, ,實時在線監(jiān)控反應過程實時在線監(jiān)控反應過程, ,結結合相應的軟件可以對結果進行分析合相應的軟件可以對結果進行分析, ,計算待測樣品的計算待測樣品的初始模板量。初始模板量。 I2021/3/9615353SGSGSGSGSGExcitationEmission 2021/3/962 實時熒光定量實時熒光定量PCR儀儀梯度梯度PCR儀儀普通普通PCR儀儀 確定一條染色體片斷上的堿基順

32、序。 Sanger法： 在PCR時加入熒光標記的復制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應于4種堿基） ddX的兩個作用： 可以當作正常堿基參與復制 一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接 電泳 誰終止，堿基就是誰 此方法獲1974年的Nobel獎熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快 DNA的提取和純化 載體預備：DNA片斷結合，從而能夠在細菌中擴增。 DNA片段的制備：將DNA用超聲波切成能夠測序的小片斷 轉化培養(yǎng)：小片斷和載體結合，植入細菌中進行擴增。 提質粒：從細菌中提取出繁殖好的質粒 電泳檢測：檢測質量的好壞 測序：上測序儀測序DNA整體切成小段小段和載體結合結合后進行測序2021/

33、3/9702021/3/971 經典遺傳學中基因的概念 l孟德爾稱控制性狀的因子為遺傳因子 l1909年約翰生提出了基因這個名詞，取代孟德爾的遺傳因子l摩爾根等人對果蠅、玉米等的大量遺傳研究，建立了以基因和染色體為主體的經典遺傳學 經典遺傳學認為：基因是遺傳上最小的結構與功能單位，不能分割。是結構與功能的統(tǒng)一體2021/3/972 分子遺傳學中基因的概念 基因的本質： （1）基因是特定長度和堿基序列的DNA片段 （2）核苷酸序列中蘊藏著遺傳信息： mRNA 多肽 DNA tRNA rRNA 調節(jié)基因 無翻譯產物無翻譯產物翻翻 譯譯轉轉 錄錄無轉錄產物無轉錄產物結構結構基因基因2021/3/973l根據基因的原初功能可以將基因分為：根據基因的原初功能可以將基因分為：(1) 編碼蛋白質的基因，即有翻譯產物的基因。編碼蛋白質的基因，即有翻譯產物的基因。 如結構蛋白、酶等如結構蛋白、酶等結構基因結構基因和產生調節(jié)蛋白的和產生調節(jié)蛋白的調節(jié)調節(jié)基因基因。(2)沒有翻譯產物，不產生蛋白質的基因。沒有翻譯產物，不產生蛋白質的基因。 轉錄產物轉錄產物RNA不翻譯，