大黃素、黃芪多糖在體外對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用

1、大黃素、黃芪多糖在體外對(duì)乙型肝炎病毒的抑制作用 08-01-15 11:18:00 編輯：studa20 作者：黨雙鎖張正國(guó)張欣宋平邊靜程延安 【摘要】【關(guān)鍵詞】 大黃素；黃芪多糖；乙型肝炎病毒；細(xì)胞培養(yǎng)Inhibition on hepatitis B virus by emodinand astragalus polysaccharides in vitrotime PC and concentrationn vitro (P0.05). The interaction was not significant between emodin and APS (P0.05). Conclusi

2、on Emodin had time and concentrationdependent inhibitory effects to HBV in vitro in some extent; APS could not inhibit HBV obviously in vitro; Coadministration of emodin and APS had not significant interaction in restraining HBV in vitro.KEY WORDS: emodin; astragalus polysaccharides; hepatitis B vir

3、us; cell culture1 材料與方法1.1 藥物 大黃素(純度950g/L購(gòu)自西安崇信天然添加劑有限公司，由國(guó)家中藥鑒定所鑒定，批文號(hào)：25100806)，黃芪多糖(純度為600g/L，西安鴻生生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國(guó)家中藥鑒定所鑒定，批號(hào)：040618)，干擾素(購(gòu)自羅氏公司，批號(hào)：010801I)，拉米夫定(3TC)0.1mmol/L的母液，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院提供。1.2 試劑及主要儀器 噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，二甲基亞砜(DMSO, Sigma)，HBsAg和HBeAg的ELESA檢測(cè)試劑盒(上海華泰生物工程公司)，HBV DNA提取及擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒(廣州中山大學(xué)達(dá)

4、安基因股份有限公司)，和PE7700型自動(dòng)熒光PCR儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)。1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 2.5g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1104個(gè)/孔接種于96孔板，每孔200L，于37、50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后，換培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分3大組，17個(gè)劑量組，分組如下：陽(yáng)性對(duì)照組分別為干擾素(INF)、拉米夫定，各設(shè)3個(gè)劑量組(125000、250000、500000u/L INF ；0.025、0.05、0.1mol/L 3TC)；實(shí)驗(yàn)組為3個(gè)組，即大黃素組(12.5、25.0、50.0mg/L)，黃芪多糖組(120、240、480g/L)

5、，聯(lián)合用藥組(25.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，50.0mg/L大黃素120g/L黃芪多糖，25.0mg/L大黃素240g/L黃芪多糖，50.0mg/L大黃素240g/L黃芪多糖)；陰性對(duì)照組即生理鹽水組，用等體積生理鹽水加入。實(shí)驗(yàn)中除陰性對(duì)照組設(shè)10個(gè)復(fù)孔外，其余每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，用含藥物培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)。每3d換同樣濃度含藥培養(yǎng)液及對(duì)照培養(yǎng)液1次。各孔在3、6、9d時(shí)，將吸去的上清液置于-20冰箱保存待檢。1.6 MTT實(shí)驗(yàn) 加藥第9天吸去上清，每孔加5g/L的MTT 20L，37培養(yǎng)4h，棄上清后，每孔加入150L DMSO，震蕩10min，測(cè)定570nm吸光度。按下列公

6、式計(jì)算細(xì)胞的抑制百分率。細(xì)胞抑制百分率=陰性對(duì)照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值陰性對(duì)照組平均A值100%按下列公式計(jì)算藥物的半數(shù)細(xì)胞毒性濃度(CC50)。CC50= lg-1B+0.5-50%抑制百分率-50%抑制百分率C (B=lg50%藥物濃度，C=lg2)1.7 熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞外HBV DNA1 按照達(dá)安基因股份有限公司HBV核酸提取與核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒說明書操作。兩引物序列分別為P15ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3，P25ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3，熒光探針序列為5TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3。各反應(yīng)管放入PE77

7、00自動(dòng)熒光PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：93 2min預(yù)變性，然后93 45s到55 1min循環(huán)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再按93 30s到55 45s循環(huán)擴(kuò)增，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析出HBV DNA定量結(jié)果。按照下面公式計(jì)算藥物對(duì)HBV DNA的抑制率。 HBV DNA抑制率=陰性對(duì)照組HBV DNA拷貝數(shù)-實(shí)驗(yàn)組HBV DNA拷貝數(shù)陰性對(duì)照組HBV DNA拷貝數(shù)100% 按下列公式計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。 IC50=lg-1B+0.5-50%抑制百分率-50%抑制百分率C (B= lg 50%藥物濃度，C=lg 稀釋倍數(shù)的倒數(shù)) 治療指數(shù)(TI)= CC50/IC50。1.8 HBsAg和HBeAg的測(cè)定 使用雙抗體加心ELESA法1。根據(jù)試劑盒說明測(cè)定培養(yǎng)上清液的HBsAg和HBeAg，記錄P/N值，按照下面公式計(jì)算藥物對(duì)HBV DNA的抑制率。HBsAg(HBeAg)抑制率=對(duì)照組P/N值-藥物組P/N值對(duì)