第十六章：哺乳動物基因工程

1、第十六章第十六章 哺乳動物基因工程哺乳動物基因工程第一節(jié)第一節(jié) 高等哺乳動物基因工程的基本概念高等哺乳動物基因工程的基本概念 概念：概念： 動物基因工程是利用動物基因工程是利用DNADNA重組技重組技術對動物所進行的工程操作。術對動物所進行的工程操作。 遺傳學動物基因工程：外源基因能遺傳學動物基因工程：外源基因能夠通過配子進行垂直傳遞并穩(wěn)定的夠通過配子進行垂直傳遞并穩(wěn)定的遺傳。遺傳。 非遺傳性動物基因工程：轉基因僅非遺傳性動物基因工程：轉基因僅在當代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。在當代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。 分為：分為：高等哺乳動物的基因工程高等哺乳動物轉基因技術高等哺乳動物細胞基因表達技術轉基因

2、動物個體動物工程細胞哺乳動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白質多肽物質大規(guī)模生產藥物篩選研究評價模型第二節(jié)第二節(jié) 轉基因的動物受體細胞轉基因的動物受體細胞一、高等哺乳動物細胞的生長特性一、高等哺乳動物細胞的生長特性 正常的哺乳類動物細胞具有下列正常的哺乳類動物細胞具有下列四大生物學特征：四大生物學特征：錨地依賴性：細胞必須附在固體錨地依賴性：細胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂。上或固定的表面才能生長分裂。血清依賴性：細胞必須具有生長因血清依賴性：細胞必須具有生長因子才能生長。子才能生長。接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生長便受到抑制。生長便受

3、到抑制。形態(tài)依賴性：細胞呈扁平狀，并有形態(tài)依賴性：細胞呈扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結構。長纖維網(wǎng)狀結構。上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活養(yǎng)中，一般只能存活5050代且在培養(yǎng)皿上以平代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變某些特征而越過生理臨界點，常細胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。系形成，此時的細胞成為細胞系。二、高等哺乳動物受體細胞的條件二、高等哺乳動物受體細胞的

4、條件 以高效表達外源基因的高等哺乳以高效表達外源基因的高等哺乳動物受體細胞應具備下列條件：動物受體細胞應具備下列條件：細胞系特征：喪失細胞接觸抑制細胞系特征：喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)。模培養(yǎng)。遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存。后不至于丟失，易于長期保存。合適的標記：便于轉化株的篩選合適的標記：便于轉化株的篩選和保持。和保持。生長快且齊：分裂周期短，生長均生長快且齊：分裂周期短，生長均一，便于控制。一，便于控制。安全性能好：不合成分泌致病物質，安全性能好：不合成分泌致病物質，不致癌。不致癌。三

5、、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記三、高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記 營養(yǎng)缺陷型哺乳動物受體細胞營養(yǎng)缺陷型哺乳動物受體細胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（含有胸腺嘧啶核苷激酶（TKTK）編碼基因缺）編碼基因缺陷的受體細胞（陷的受體細胞（tk-tk-）：不能在含有次黃嘌）：不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基（基（HATHAT培養(yǎng)基）上生長，載體上的標記基培養(yǎng)基）上生長，載體上的標記基因因tktk能與之遺傳互補。能與之遺傳互補。含有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（含有次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶（HPRTHPRT）編）編碼基因缺陷的受體細胞（碼基因缺陷的受體細胞（hp

6、rt-hprt-）：不能在）：不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基（核苷的培養(yǎng)基（HATHAT培養(yǎng)基）上生長，載體培養(yǎng)基）上生長，載體上的標記基因上的標記基因hprthprt能與之遺傳互補。能與之遺傳互補。 哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記：哺乳動物受體細胞常見的遺傳選擇標記： 常用的高等哺乳動物受體細胞常用的高等哺乳動物受體細胞目前，用于醫(yī)療用品大規(guī)模生產的高目前，用于醫(yī)療用品大規(guī)模生產的高等哺乳動物受體細胞主要是：中國倉等哺乳動物受體細胞主要是：中國倉鼠卵巢細胞。鼠卵巢細胞。遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定。遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定。與人

7、的親緣關系接近，外源蛋白修與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確。飾準確?；蜣D移和載體表達系統(tǒng)完善?；蜣D移和載體表達系統(tǒng)完善。其優(yōu)勢如下：其優(yōu)勢如下：耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)。耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)。被美國被美國FDAFDA確認為安全的基因工程受體確認為安全的基因工程受體細胞。細胞。第三節(jié)第三節(jié) 轉基因導入動物體內的方法轉基因導入動物體內的方法一、動物細胞物理轉化法一、動物細胞物理轉化法優(yōu)點：轉基因不含任何病毒基因組片優(yōu)點：轉基因不含任何病毒基因組片段，對于基因治療尤為安全。段，對于基因治療尤為安全。缺點：轉基因進入細胞后往往多拷貝缺點：轉基因進入細胞后往往多拷貝隨機整合在染色體上，導

8、致受體細隨機整合在染色體上，導致受體細胞基因滅活或轉基因不表達。胞基因滅活或轉基因不表達。 基本步驟基本步驟細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNADNA的能力。的能力。將待轉移的將待轉移的DNADNA加入氯化鈣和磷酸鹽，加入氯化鈣和磷酸鹽，生成生成DNA-DNA-磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中。磷酸鈣沉淀，加入培養(yǎng)液中。 磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法由于細胞的吞噬作用，由于細胞的吞噬作用，DNA-DNA-磷酸鈣沉磷酸鈣沉淀物進入細胞，淀物進入細胞，DNADNA釋出后先進入細釋出后先進入細胞質、再進入細胞核，整合到受體細胞質、再進入細胞核，整合到受體細胞的染色體上。胞的染色體上

9、。DNA-DNA-磷酸鈣共沉淀物中磷酸鈣共沉淀物中DNADNA的數(shù)量；的數(shù)量；共沉淀物與細胞接觸的保溫時間；共沉淀物與細胞接觸的保溫時間；甘油或甘油或DMSODMSO等促進因子作用的持續(xù)等促進因子作用的持續(xù)時間等。時間等。 影響磷酸鈣轉染效率的因素：影響磷酸鈣轉染效率的因素：培養(yǎng)皿號培養(yǎng)皿號(10 cm) pXGH5(ug)pUC13(ug)細胞與沉細胞與沉淀物的保淀物的保溫時間溫時間(h)甘油刺激甘油刺激時間時間(min)1556-25156-35356-45516-551516-653516-7556385156395356310551631151516312535163磷酸鈣轉染的最適條

10、件篩選 電擊轉化法（電擊轉化法（electroporationelectroporation）將受體細胞懸浮于含有待轉化將受體細胞懸浮于含有待轉化DNADNA的溶液中，在盛有上述懸浮液的電的溶液中，在盛有上述懸浮液的電擊池兩端施加短暫的脈沖電場，使擊池兩端施加短暫的脈沖電場，使細胞膜產生細小的空洞并增加其通細胞膜產生細小的空洞并增加其通透性，此時外源透性，此時外源DNADNA片段便能不經片段便能不經胞飲作用直接進入細胞質。胞飲作用直接進入細胞質。脈沖的最大電壓脈沖的最大電壓脈沖持續(xù)的時間脈沖持續(xù)的時間影響因素：影響因素：與與DNADNA濃度則無多大關系。濃度則無多大關系。 脂質體包埋法脂質體包

11、埋法脂質體脂質體(liposomes)(liposomes)是一種人造的脂是一種人造的脂質小泡質小泡(lipid vesicles)(lipid vesicles)，外周是脂，外周是脂雙層，內部是水腔。用它作載體可以雙層，內部是水腔。用它作載體可以把外源把外源DNADNA導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。導入培養(yǎng)的哺乳動物細胞。將適宜的脂質懸浮在液體介質中，將適宜的脂質懸浮在液體介質中，然后迅速地振蕩，使之形成大小相然后迅速地振蕩，使之形成大小相當一致的脂質體；當一致的脂質體；用小型的注射針頭，將脂質注射到用小型的注射針頭，將脂質注射到酒精水溶液中，并快速混勻。酒精水溶液中，并快速混勻。 脂質體的制備的

12、兩種方法：脂質體的制備的兩種方法： 脂質轉染法：以脂質體為媒介的外源脂質轉染法：以脂質體為媒介的外源DNADNA導入受體的方法，叫做脂質轉染法。導入受體的方法，叫做脂質轉染法。第一種脂質轉染法：將外源第一種脂質轉染法：將外源DNADNA與陽離子與陽離子型的脂質體混合形成型的脂質體混合形成DNA-DNA-脂質復合物。脂質復合物。這種復合物可有效地被受體細胞捕獲，這種復合物可有效地被受體細胞捕獲，實現(xiàn)基因的高頻率轉移，故這種方法又實現(xiàn)基因的高頻率轉移，故這種方法又叫做叫做DNA-DNA-脂質復合物轉染法。在這個過脂質復合物轉染法。在這個過程中，程中，DNADNA并不是被包裝在脂質體的內部，并不是被

13、包裝在脂質體的內部，而是通過兩者之間的靜電引力作用結合而是通過兩者之間的靜電引力作用結合在一起的。在一起的。第二種脂質體轉染法又稱脂質體載體法：第二種脂質體轉染法又稱脂質體載體法：它是將外源它是將外源DNADNA包裝在脂質體的內部，然包裝在脂質體的內部，然后通過脂質體的雙層膜同受體細胞膜之間后通過脂質體的雙層膜同受體細胞膜之間的融合作用，使外源的融合作用，使外源DNADNA進入細胞質，爾進入細胞質，爾后再進入細胞核，實現(xiàn)基因的表達。后再進入細胞核，實現(xiàn)基因的表達。制備程序比較簡單，可以通過多制備程序比較簡單，可以通過多聚碳酸脂濾膜消毒滅菌；聚碳酸脂濾膜消毒滅菌；用它包裝的用它包裝的DNADNA

14、在在44下可長期保下可長期保存不失活性，存不失活性， 脂質體載體法的優(yōu)越性：脂質體載體法的優(yōu)越性： DNADNA顯微注射法顯微注射法應用玻璃顯微注射器，可以把重組應用玻璃顯微注射器，可以把重組DNADNA直接注射到哺乳動物細胞的細胞直接注射到哺乳動物細胞的細胞質或細胞核。質或細胞核。真正的顯微注射真正的顯微注射(true microinjection)(true microinjection)法，法，DNADNA是由注射針直接注入細胞。是由注射針直接注入細胞?！按┐檀┐獭?pricking)(pricking)導入法，導入法，DNADNA是是處在細胞周圍培養(yǎng)基中，它通過穿處在細胞周圍培養(yǎng)基中，

15、它通過穿刺形成的小孔進入細胞的內部，或刺形成的小孔進入細胞的內部，或是隨穿刺的針頭一道進入的。是隨穿刺的針頭一道進入的。二、動物病毒轉染法二、動物病毒轉染法通過病毒感染的方式將外源基因通過病毒感染的方式將外源基因導入動物細胞內的轉基因方法。導入動物細胞內的轉基因方法。具有定向性好，實驗重復性佳，具有定向性好，實驗重復性佳，導入效率高等優(yōu)點。缺點是載體導入效率高等優(yōu)點。缺點是載體宿主范圍有限。宿主范圍有限。 動物病毒的特點：動物病毒的特點：具有能夠被真核細胞識別的有效具有能夠被真核細胞識別的有效的啟動子；的啟動子；在感染周期中能夠持續(xù)地復制使在感染周期中能夠持續(xù)地復制使基因達到相當高濃度，并實現(xiàn)

16、有基因達到相當高濃度，并實現(xiàn)有效地表達；效地表達；病毒具有能夠控制自身復制的順病毒具有能夠控制自身復制的順式元件和反式作用因子，改造后式元件和反式作用因子，改造后可發(fā)展成為能夠在細胞內長時間可發(fā)展成為能夠在細胞內長時間地保持高拷貝的外源基因的復制地保持高拷貝的外源基因的復制型質粒載體；型質粒載體；能高效穩(wěn)定地整合到染色體，可提能高效穩(wěn)定地整合到染色體，可提高外源基因導入寄主細胞染色體的高外源基因導入寄主細胞染色體的效率；效率；病毒外殼蛋白能夠識別細胞接受器，病毒外殼蛋白能夠識別細胞接受器，能夠將外源蛋白高效地導入宿主細能夠將外源蛋白高效地導入宿主細胞（假病毒粒子法）。胞（假病毒粒子法）。 腺病

17、毒（腺病毒（AdenovirusesAdenoviruses）一群無囊膜的一群無囊膜的2020面體的病毒，其雙鏈面體的病毒，其雙鏈DNADNA的分子大小約為的分子大小約為36kb36kb。腺病毒可插入較大的外源腺病毒可插入較大的外源DNADNA片段，片段，而且還可以在寄主細胞中大量地增殖。而且還可以在寄主細胞中大量地增殖。其次，能最大限度地合成病毒編碼的其次，能最大限度地合成病毒編碼的蛋白質。蛋白質。帶有反向的末端重復序列，而且在每帶有反向的末端重復序列，而且在每一條單鏈的一條單鏈的5-5-末端還共價地連接著末端還共價地連接著一種蛋白質分子。一種蛋白質分子。當它從病毒顆粒中分離出來之時，便當它

18、從病毒顆粒中分離出來之時，便會自發(fā)地環(huán)化起來，爾后許多環(huán)形分會自發(fā)地環(huán)化起來，爾后許多環(huán)形分子又聚合成多聚體。子又聚合成多聚體。 腺病毒的一般生物學特性腺病毒的一般生物學特性其基因組長約其基因組長約36kb36kb，兩端各有一個，兩端各有一個反向末端重復區(qū)（反向末端重復區(qū)（ITRITR），），ITRITR內側內側為病毒包裝信號?；蚪M上分布著為病毒包裝信號?；蚪M上分布著4 4個早期轉錄元（個早期轉錄元（E1E1、E2E2、E3E3、E4E4）承擔調節(jié)功能，以及一個晚期轉錄承擔調節(jié)功能，以及一個晚期轉錄元負責結構蛋白的編碼。元負責結構蛋白的編碼。 腺病毒載體的構建策略有三種腺病毒載體的構建策略

19、有三種在細胞內同源重組產生重組腺病毒，首在細胞內同源重組產生重組腺病毒，首先要純化出全長的腺病毒先要純化出全長的腺病毒DNADNA，外源基，外源基因插入到帶有腺病毒基因片段的穿梭質因插入到帶有腺病毒基因片段的穿梭質粒中，將腺病毒粒中，將腺病毒DNADNA和重組質粒共轉染和重組質粒共轉染表達表達E1E1基因產物的基因產物的HEK293HEK293細胞中，通過細胞中，通過噬斑篩選出重組病毒。噬斑篩選出重組病毒。將腺病毒全長將腺病毒全長DNADNA序列克隆入序列克隆入CosmidCosmid質粒質粒中，轉化大腸桿菌感受菌，在細菌中復制中，轉化大腸桿菌感受菌，在細菌中復制腺病毒腺病毒DNADNA序列，

20、然后將外源基因片段插序列，然后將外源基因片段插入帶適當抗性基因的真核表達質粒，將重入帶適當抗性基因的真核表達質粒，將重組真核質粒線性化后，轉化帶組真核質粒線性化后，轉化帶CosmidCosmid質粒質粒的大腸桿菌，在高表達的大腸桿菌，在高表達CreCre重組酶的大腸重組酶的大腸桿菌發(fā)生同源重組，將外源基因表達盒插桿菌發(fā)生同源重組，將外源基因表達盒插入腺病毒入腺病毒DNADNA中，用這種方法也可以缺失中，用這種方法也可以缺失任何區(qū)段的腺病毒任何區(qū)段的腺病毒DNADNA。將稀有的限制性內切酶位點引入穿梭質將稀有的限制性內切酶位點引入穿梭質粒和腺病毒骨架載體中，將外源基因克粒和腺病毒骨架載體中，將外

21、源基因克隆入穿梭質粒中，再通過酶切連接的方隆入穿梭質粒中，再通過酶切連接的方法將外源基因克隆入腺病毒骨架載體，法將外源基因克隆入腺病毒骨架載體，轉化大腸桿菌復制重組質粒，轉染相應轉化大腸桿菌復制重組質粒，轉染相應的包裝細胞系后，即可產生復制缺陷型的包裝細胞系后，即可產生復制缺陷型的重組腺病毒。的重組腺病毒。 腺病毒腺病毒DNADNA載體的特點：載體的特點：基因重排低：外源基因與病毒基因重排低：外源基因與病毒DNADNA重組后能穩(wěn)定復制幾個周期。重組后能穩(wěn)定復制幾個周期。安全性能好：不整合人的染色體安全性能好：不整合人的染色體DNADNA，不會導致惡性腫瘤。，不會導致惡性腫瘤。宿主范圍廣：對受體

22、細胞是否處于宿主范圍廣：對受體細胞是否處于分裂期要求不嚴格。分裂期要求不嚴格。使用效果好：外源基因在載體上容使用效果好：外源基因在載體上容易高效表達。易高效表達。 猴腫瘤病毒（猴腫瘤病毒（SV40SV40）蛋白質蛋白質 合成時間合成時間功能功能T抗原 早期啟動DNA復制t抗原早期 未知VP1 晚期主要的病毒外殼蛋白VP2 晚期次要的病毒外殼蛋白VP3 晚期次要的病毒外殼蛋白SV40SV40病毒編碼的蛋白質病毒編碼的蛋白質在在SV40SV40病毒基因組中存在著一個增強子病毒基因組中存在著一個增強子序列。其長度為序列。其長度為72bp72bp，以串聯(lián)重復的形，以串聯(lián)重復的形式位于基因組式位于基因組

23、DNADNA復制起點的附近，它復制起點的附近，它的主要功能是促進病毒的主要功能是促進病毒DNADNA發(fā)生有效的發(fā)生有效的早期轉錄，而且具有一般增強子所共有早期轉錄，而且具有一般增強子所共有的基本特性。的基本特性。 SV40SV40病毒的增強子序列病毒的增強子序列野生型的野生型的SV40SV40病毒顆粒的包裝范圍相當嚴格，病毒顆粒的包裝范圍相當嚴格，超過其基因組大小超過其基因組大小(5.2kb)(5.2kb)的重組的重組DNADNA就不能夠就不能夠被包裝為成熟的病毒顆粒。而且，被包裝為成熟的病毒顆粒。而且，SV40SV40還存在還存在著寄主細胞的局限性，它只能在受納細胞中增著寄主細胞的局限性，它

24、只能在受納細胞中增殖，并最終導致寄主細胞的死亡，這樣就不能殖，并最終導致寄主細胞的死亡，這樣就不能作長期的培養(yǎng)使用。因此，野生型的作長期的培養(yǎng)使用。因此，野生型的SV40SV40病毒病毒必須經過改造之后，才能發(fā)展成為基因克隆的必須經過改造之后，才能發(fā)展成為基因克隆的有用載體。有用載體。 以以SV40SV40為基礎的基因克隆載體，主要有為基礎的基因克隆載體，主要有兩種不同的類型：兩種不同的類型： 取代型的重組病毒載體：外源取代型的重組病毒載體：外源DNADNA是直接插入是直接插入在缺陷性的病毒基因組上。由于插入的外源在缺陷性的病毒基因組上。由于插入的外源DNADNA片段，在大小上同被取代的病毒基

25、因組區(qū)片段，在大小上同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，因此形成的重組體段是等同的，因此形成的重組體DNADNA能夠在哺能夠在哺乳動物的受納細胞中增殖，并被包裝成病毒顆乳動物的受納細胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補充這段被取代的病毒基因組粒。但為了補充這段被取代的病毒基因組DNADNA的功能，必須使用一種與之互補的輔助病毒。的功能，必須使用一種與之互補的輔助病毒。利用利用SV40 DNA載體表達外源基因的程序：載體表達外源基因的程序：重組的病毒重組的病毒- -質粒載體：在這類載體中，病毒質粒載體：在這類載體中，病毒基因組部分只保留下維持在哺乳動物細胞中進基因組部分只保留下維持在哺乳動物細胞

26、中進行復制所必須的有關序列，但它融合上了一個行復制所必須的有關序列，但它融合上了一個細菌質粒，因而還能夠在大腸桿菌細胞中進行細菌質粒，因而還能夠在大腸桿菌細胞中進行復制和增殖。不過這種重組體分子沒有被包裝復制和增殖。不過這種重組體分子沒有被包裝成病毒顆粒，不會出現(xiàn)裂解感染的情況，它實成病毒顆粒，不會出現(xiàn)裂解感染的情況，它實際上是一種類似于質粒的際上是一種類似于質粒的DNADNA分子載體。分子載體。 SV40 DNASV40 DNA載體的特點：載體的特點：基因表達好：外源基因能高效表達；基因表達好：外源基因能高效表達；基因重排高：病毒基因組和重組分子基因重排高：病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺

27、失現(xiàn)象；常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象；宿主范圍窄：只能轉染猴細胞；宿主范圍窄：只能轉染猴細胞；裝載量較小。裝載量較小。 反轉錄病毒載體反轉錄病毒載體在大多數(shù)情況下，反轉錄病毒的腫在大多數(shù)情況下，反轉錄病毒的腫瘤基因都能夠在正常的細胞中轉錄。瘤基因都能夠在正常的細胞中轉錄。反轉錄病毒的寄主范圍相當廣泛，反轉錄病毒的寄主范圍相當廣泛，包括無脊椎動物和脊椎動物。包括無脊椎動物和脊椎動物。 反轉錄病毒具有許多優(yōu)點，便于發(fā)展反轉錄病毒具有許多優(yōu)點，便于發(fā)展作為動物基因克隆載體。作為動物基因克隆載體。反轉錄病毒具有強啟動子，克隆此反轉錄病毒具有強啟動子，克隆此類載體上的外源基因有可能得到有類載體上的外源基因有可能

28、得到有效的表達。效的表達。反轉錄病毒不但感染效率高，而且反轉錄病毒不但感染效率高，而且通常還不會招致寄主細胞的死亡，通常還不會招致寄主細胞的死亡，被它感染的或轉化的動物細胞能夠被它感染的或轉化的動物細胞能夠持續(xù)許多世代，保持正常生長和形持續(xù)許多世代，保持正常生長和形成感染性病毒顆粒的能力。成感染性病毒顆粒的能力。 反轉錄病毒的一般生物學特性反轉錄病毒的一般生物學特性 反轉錄病毒載體的主要類型反轉錄病毒載體的主要類型 輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載體輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載體此種帶外源選擇標記基因的重組此種帶外源選擇標記基因的重組病毒基因組有缺陷，不能合成自病毒基因組有缺陷，不能合成自身蛋

29、白質，故包裝所需的全部蛋身蛋白質，故包裝所需的全部蛋白質需靠輔助病毒提供。白質需靠輔助病毒提供。 不需要輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載體不需要輔助病毒互補的反轉錄病毒質粒載體當用缺陷性的重組的反轉錄病毒質粒載當用缺陷性的重組的反轉錄病毒質粒載體，例如體，例如pMLV-gpt DNApMLV-gpt DNA傳染傳染22包裝細包裝細胞株時，它便會整合到寄主染色體胞株時，它便會整合到寄主染色體DNADNA上進行轉錄，合成出具有上進行轉錄，合成出具有psipsi序列的反序列的反轉錄病毒載體轉錄病毒載體RNARNA。三、工程胚胎干細胞法三、工程胚胎干細胞法 胚胎干細胞胚胎干細胞(embryonic st

30、em cell(embryonic stem cell，ES)ES)是指從哺乳動物胚胎囊胚期內的細是指從哺乳動物胚胎囊胚期內的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，這種細胞具有發(fā)育的多能性，能胞，這種細胞具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織。夠分化出各種組織。胚胎干細胞介導法：是將外源基因直接導人胚胎干細胞介導法：是將外源基因直接導人ESES細細胞，經體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中，胞，經體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中，與其中的囊胚細胞聚集在一起，成為受體胚胎的與其中的囊胚細胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。由這種胚胎發(fā)育而成嵌合一部分，參

31、與其分化。由這種胚胎發(fā)育而成嵌合體的轉基因動物，即其中有一部分組織來源于整體的轉基因動物，即其中有一部分組織來源于整合有外源基因的供體合有外源基因的供體ESES細胞。在嵌合過程中，被細胞。在嵌合過程中，被轉化的轉化的ESES細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將引人的外源基因傳遞下去。引人的外源基因傳遞下去。第四節(jié)第四節(jié) 利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白利用哺乳動物工程細胞生產重組蛋白哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理某些氨基酸在代謝過程中能生成含一個碳原子某些氨基酸在代謝過程中能生成含一個碳原子的基團，經過轉移參與生物合

32、成過程。體內的的基團，經過轉移參與生物合成過程。體內的一碳單位有：甲基一碳單位有：甲基( (CH3CH3，methyl)methyl)、甲烯基、甲烯基( ( C H 2C H 2 ， m e t h y l e n e )m e t h y l e n e ) ， 甲 炔 基， 甲 炔 基 ( ( C HC H,methenyl),methenyl)、甲酰基、甲?；?-CHO,formyl)(-CHO,formyl)及亞氨甲及亞氨甲基基(-CH(-CHNH,formimino)NH,formimino)等。等。 一碳單位的代謝一碳單位的代謝一碳單位不能游離存在，通常由其載體四氫一碳單位不能游離

33、存在，通常由其載體四氫葉酸（葉酸（FH4FH4）攜帶。）攜帶。 哺乳動物細胞內的基因擴增現(xiàn)象哺乳動物細胞內的基因擴增現(xiàn)象氨基喋呤（氨基喋呤（MTXMTX）是二氫葉酸還原酶（）是二氫葉酸還原酶（DHFRDHFR）的特）的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經氨甲蝶呤處理后，絕大異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經氨甲蝶呤處理后，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfrdhfr基因得以擴增。抗性細胞通過增加相關基因的基因得以擴增?？剐约毎ㄟ^增加相關基因的拷貝數(shù)，提高關鍵代謝酶的表達水平，從而抵消氨拷貝數(shù)，提高關鍵代謝酶的表達水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應

34、。而且與基因相鄰的甲喋呤的抑制效應。而且與基因相鄰的DNADNA區(qū)域同區(qū)域同時也被擴增。時也被擴增。 DHFR-MTXDHFR-MTX系統(tǒng)系統(tǒng) GS-MSXGS-MSX高效表達系統(tǒng)：高效表達系統(tǒng)：谷氨酰胺合成酶（谷氨酰胺合成酶（GSGS）能解除甲硫氨酸亞砜（）能解除甲硫氨酸亞砜（MSXMSX）對動物細胞的毒害作用。先將帶有對動物細胞的毒害作用。先將帶有GSGS編碼基因的編碼基因的載體轉入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，由于只有多拷載體轉入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，由于只有多拷貝的貝的GSGS編碼基因才能抗編碼基因才能抗MSXMSX，所以在轉染過程中不，所以在轉染過程中不必使用必使用GSGS缺陷型的受體細胞，

35、而且在正常的缺陷型的受體細胞，而且在正常的MSXMSX濃濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，這是這是GS-MSXGS-MSX系統(tǒng)比系統(tǒng)比DHFR-MTXDHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。系統(tǒng)優(yōu)越之處。 通過強化基因轉錄高效表達外源基因通過強化基因轉錄高效表達外源基因在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟動在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟動子以及有效的翻譯元件，也可使外源基子以及有效的翻譯元件，也可使外源基因高效表達。因高效表達。細胞巨化病毒細胞巨化病毒CMVCMV的啟動子的啟動子動物珠蛋白基因的內含子動物珠蛋白基因的內含子SV40SV40的終止子和的

36、終止子和polyApolyA化信號序列化信號序列絕大多數(shù)哺乳動物細胞絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體上攜帶內的表達型載體上攜帶內含子結構，因為含子結構，因為mRNAmRNA前前體的剪切能促進成熟體的剪切能促進成熟mRNAmRNA向胞質的運輸，有向胞質的運輸，有利于翻譯，有的還有信利于翻譯，有的還有信號肽序列。號肽序列。利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴癌細胞表面上都有一種特異大多數(shù)惡性淋巴癌細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白性的糖蛋白campathcampath。用人源化的小鼠抗。用人源化的小鼠抗campathcampath抗體治療非霍

37、金淋巴細胞瘤患者，抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用效果良好。重組抗體采用DHFR-MTXDHFR-MTX系統(tǒng)表達。系統(tǒng)表達。利用哺乳動物工程細胞生產人組織纖溶酶利用哺乳動物工程細胞生產人組織纖溶酶原激活劑原激活劑第一個由重組哺乳動物細胞規(guī)模化生產第一個由重組哺乳動物細胞規(guī)?；a的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血的醫(yī)用蛋白是治療急性心肌梗塞的溶血栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（栓藥物：人組織纖溶酶原激活劑（tPAtPA）。）。同樣采用同樣采用DHFR-MTXDHFR-MTX系統(tǒng)表達。人系統(tǒng)表達。人tPAtPA也可也可由重組大腸桿菌生產，但蛋白的重折疊由重組大腸桿菌生產，但蛋白

38、的重折疊效率低。效率低。第五節(jié)第五節(jié) 轉基因動物的應用研究轉基因動物的應用研究 改良動物經濟性狀的嘗試改良動物經濟性狀的嘗試試圖通過轉移單個基因改良動物經濟性狀試圖通過轉移單個基因改良動物經濟性狀的研究，至今仍未見成功的報道，尚需對的研究，至今仍未見成功的報道，尚需對性狀表現(xiàn)的生化代謝途徑，有關基因的相性狀表現(xiàn)的生化代謝途徑，有關基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表達、互作用以及基因定位整合，基因定量表達、組織特異性表達等進行深入的研究。組織特異性表達等進行深入的研究。乳腺生物反應器的研究乳腺生物反應器的研究19871987年，年，GordonGordon首次報道小鼠乳腺中表達首次報道小

39、鼠乳腺中表達tPAtPA蛋白。至今國際上轉基因羊、轉基因牛蛋白。至今國際上轉基因羊、轉基因牛等的成功報道實例已有等的成功報道實例已有1010多種，生產出抗胰多種，生產出抗胰蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子蛋白酶、乳鐵蛋白、人凝血蛋白因子、蛋、蛋白質白質C C等藥用蛋白。國外經濟學家預期，等藥用蛋白。國外經濟學家預期，1010年后，轉基因動物生產的藥物銷售額超過年后，轉基因動物生產的藥物銷售額超過250250億美元。億美元。 基因藥物生產基因藥物生產第一階段是細菌基因工程第一階段是細菌基因工程第二階段是動物細胞基因工程第二階段是動物細胞基因工程第三階段是轉基因動物第三階段是轉基因動物乳腺生物反應

40、器。乳腺生物反應器。乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達乳腺是自我封閉系統(tǒng)，乳腺表達的蛋白質不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，的蛋白質不回流到血液循環(huán)系統(tǒng)，避免外源基因表達的蛋白質對動避免外源基因表達的蛋白質對動物本身的影響；物本身的影響； 轉基因動物轉基因動物乳腺生物反應器具有以乳腺生物反應器具有以下特點：下特點：乳腺組織是一種有效的蛋白質合成乳腺組織是一種有效的蛋白質合成器。一頭奶牛一年可生產乳蛋白器。一頭奶牛一年可生產乳蛋白250-300Kg250-300Kg，一只綿羊或山羊一年，一只綿羊或山羊一年可生產乳蛋白可生產乳蛋白25-30Kg25-30Kg。如果有百。如果有百分之一的乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，分之一的

41、乳蛋白代換成醫(yī)用蛋白，產量十分可觀。產量十分可觀。乳腺分泌的基因產物不但產量高，乳腺分泌的基因產物不但產量高，而且易提純。表達的蛋白經過充分而且易提純。表達的蛋白經過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。生物活性接近天然產品。生物活性接近天然產品。在動物乳腺表達的外源基因可以在動物乳腺表達的外源基因可以遺傳，可用常規(guī)技術繁殖生產群遺傳，可用常規(guī)技術繁殖生產群體。體。 提高動物的抗病能力提高動物的抗病能力 通過克隆特定病毒基因組中的某些通過克隆特定病毒基因組中的某些編碼片段，對其加以一定的修飾后轉編碼片段，對其加以一定的修飾后轉入畜禽基因組，如果轉基因在宿主基入畜禽

42、基因組，如果轉基因在宿主基因組中能得以表達，那么畜禽對該種因組中能得以表達，那么畜禽對該種病毒的感染應具有一定的抵抗能力，病毒的感染應具有一定的抵抗能力，或者應能夠減輕該種病毒侵染時為機或者應能夠減輕該種病毒侵染時為機體帶來的傷害。體帶來的傷害。 提高動物生長速度提高動物生長速度 生長激素基因、生長激素釋放因生長激素基因、生長激素釋放因子基因、類胰島素生長因子子基因、類胰島素生長因子-1-1基基因等轉基因動物的建立已有較多因等轉基因動物的建立已有較多研究。研究。 提高動物產毛性能提高動物產毛性能 羊毛是角蛋白通過二硫鍵緊密交連組羊毛是角蛋白通過二硫鍵緊密交連組成。成。 半胱氨酸是制約羊毛質量的

43、選擇性氨半胱氨酸是制約羊毛質量的選擇性氨基酸?；帷?細菌的絲氨酸轉移酶（細菌的絲氨酸轉移酶（SATSAT）、）、D-D-乙酰乙酰絲氨硫化氫解酶（絲氨硫化氫解酶（DASDAS）可以將二硫化物）可以將二硫化物重新轉化為半胱氨酸。澳大利亞研究者重新轉化為半胱氨酸。澳大利亞研究者以以SATSAT和和DASDAS基因建立轉基因羊，以提高基因建立轉基因羊，以提高羊毛質量。羊毛質量。轉基因動物研究存在的問題轉基因動物研究存在的問題 轉基因動物的低效性轉基因動物的低效性 轉入基因引起完整基因突變轉入基因引起完整基因突變 轉入基因表達混亂轉入基因表達混亂 病毒轉基因對宿主的影響病毒轉基因對宿主的影響 轉基因動

44、物模型與預期不符轉基因動物模型與預期不符 乳腺反應器的完善乳腺反應器的完善 轉基因動物及產品的認可轉基因動物及產品的認可第六節(jié)第六節(jié) 基因治療基因治療人類遺傳疾病有人類遺傳疾病有50005000多種，基本上多種，基本上不可能用常規(guī)的方法治療。個別病不可能用常規(guī)的方法治療。個別病例只能對癥療法，減輕癥狀，但不例只能對癥療法，減輕癥狀，但不能治愈?；蛑委熆赡苁俏ㄒ坏姆侥苤斡??；蛑委熆赡苁俏ㄒ坏姆椒?。法。 背景和概念背景和概念基因治療（基因治療（gene therapygene therapy）是向）是向靶細胞導入外源基因，以糾正或靶細胞導入外源基因，以糾正或補償基因的缺陷，達到治療遺傳補償基因

45、的缺陷，達到治療遺傳病的目的。病的目的。19901990年，美國國家衛(wèi)生院（年，美國國家衛(wèi)生院（NIHNIH）重）重組組DNADNA咨詢委員會（咨詢委員會（RACRAC）批準治療）批準治療腺苷脫氨酶（腺苷脫氨酶（ADAADA）的臨床治療方案，）的臨床治療方案，2 2個病例癥狀有改善。個病例癥狀有改善。19911991年上海復旦大學與第二軍醫(yī)大年上海復旦大學與第二軍醫(yī)大學合作用基因療法治療血友病學合作用基因療法治療血友病B B的臨的臨床試驗，患者癥狀有所改善床試驗，患者癥狀有所改善 基因治療的類型基因治療的類型基因調控治療基因調控治療從基因水平調控缺陷基因的表達，從基因水平調控缺陷基因的表達，以

46、達到改善癥狀的目的。以達到改善癥狀的目的。鐮型細胞貧血癥是因珠蛋白的鐮型細胞貧血癥是因珠蛋白的鏈鏈基因突變，產生不正常的血紅蛋白基因突變，產生不正常的血紅蛋白所致。用所致。用5-5-氮胞苷抑制甲基化酶，氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關閉的使因甲基化而關閉的基因重新開基因重新開放，產生放，產生HbFHbF以代替以代替HbAHbA。用具有抑制基因表達的反義用具有抑制基因表達的反義RNARNA，或，或能切割能切割RNARNA的核酶，阻斷基因的表達。的核酶，阻斷基因的表達。在腫瘤的治療上，可以在基因水平在腫瘤的治療上，可以在基因水平上抑制腫瘤細胞基因的惡性表達和上抑制腫瘤細胞基因的惡性表達和引導腫瘤

47、細胞逆轉。引導腫瘤細胞逆轉。基因矯正治療基因矯正治療l基因增補基因增補將正?；驅牖紝⒄；驅牖颊叩捏w內，補償缺陷基因的功能。者的體內，補償缺陷基因的功能。l基因替換基因替換以正?；蛉〈円哉；蛉〈儺惖幕?。異的基因。l基因修復基因修復對異?；蜻M行原對異?；蜻M行原位的特異性修復。位的特異性修復。生殖細胞基因治療：對生殖細胞生殖細胞基因治療：對生殖細胞或早期胚胎細胞進行基因矯正?；蛟缙谂咛ゼ毎M行基因矯正。19871987年，成功治療小鼠顫抖癥、年，成功治療小鼠顫抖癥、免疫缺陷癥、地中海貧血癥等。免疫缺陷癥、地中海貧血癥等。按矯正基因的類型分為兩種基因治療：按矯正基因的類型分為

48、兩種基因治療：體細胞基因治療：以體細胞為受體體細胞基因治療：以體細胞為受體細胞，不影響下一代。常用的是細細胞，不影響下一代。常用的是細胞介導法：選擇靶細胞在體外進行胞介導法：選擇靶細胞在體外進行基因修飾，再將其輸入體內。基因修飾，再將其輸入體內。 基因治療的條件基因治療的條件對導入的基因及其產物有詳盡的了對導入的基因及其產物有詳盡的了解；解；外源基因有效導入受體細胞、穩(wěn)定外源基因有效導入受體細胞、穩(wěn)定整合、適量表達；整合、適量表達；不能使受治細胞基因組及表達調控不能使受治細胞基因組及表達調控受影響；受影響；導入基因方法安全，載體對靶細胞導入基因方法安全，載體對靶細胞無害；無害； 基因治療的原則

49、基因治療的原則對象是病情嚴重、預后極差、別無對象是病情嚴重、預后極差、別無他法的患者；他法的患者；轉移的基因被克隆；轉移的基因被克隆；無需高水平的表達和精確定量控制無需高水平的表達和精確定量控制就有治療效果；就有治療效果；靶細胞獲取或回輸安全；轉移基因靶細胞獲取或回輸安全；轉移基因的表達對細胞微環(huán)境無嚴格的特異的表達對細胞微環(huán)境無嚴格的特異性要求。性要求。 基因療法的步驟基因療法的步驟 目的基因的選擇：根據(jù)基因治療的目的基因的選擇：根據(jù)基因治療的類型選擇相應的目的基因（增補、類型選擇相應的目的基因（增補、替換、添加）替換、添加） 基因載體的構建：使目的基因在受基因載體的構建：使目的基因在受體細

50、胞內高效、可控、穩(wěn)定地表達體細胞內高效、可控、穩(wěn)定地表達 受體細胞的選擇：容易分離獲取，受體細胞的選擇：容易分離獲取，在體外增殖存活，大量擴增。如成在體外增殖存活，大量擴增。如成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓造血干纖維細胞、淋巴細胞、骨髓造血干細胞等。細胞等。 基因治療的應用基因治療的應用治療惡性腫瘤治療惡性腫瘤例如，將已導入例如，將已導入IL-2IL-2基因的基因的TILTIL細細胞回輸給病人，啟動自身免疫，胞回輸給病人，啟動自身免疫，治療黑色素瘤。美國已批準治療黑色素瘤。美國已批準8 8種基種基因治療方案。因治療方案。治療艾滋病：用射線照射已導入治療艾滋?。河蒙渚€照射已導入HIV HIV 基因的

51、成纖維細胞，細胞停止分化，基因的成纖維細胞，細胞停止分化，但能產生但能產生gp160gp160，將細胞回輸給病人，將細胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV HIV 感染細感染細胞。胞。治療家族性高膽固醇血癥（治療家族性高膽固醇血癥（FHFH） 這是肝細胞低密度脂蛋白（這是肝細胞低密度脂蛋白（LDLLDL）受）受體基因混亂造成的遺傳病，將體基因混亂造成的遺傳病，將LDLLDL基因基因導入病人離體培養(yǎng)的肝細胞中，然后導入病人離體培養(yǎng)的肝細胞中，然后經導管注入門脈循環(huán)的血液中，進入經導管注入門脈循環(huán)的血液中，進入肝細胞后表達相應的功能蛋白。肝細胞后表達相應的功能蛋白。治療先天性免疫缺陷綜合癥治療先天性免疫缺陷綜合癥 病人因缺少腺苷脫氨酶基因（病人因缺少腺苷脫氨酶基因（ADAADA）導致導致T T、B B淋巴細