離體培養(yǎng)條件下神經(jīng)生長因子對毛囊的影響

1、離體培養(yǎng)條件下神經(jīng)生長因子對毛囊的影響屠軍波1, 楊壯群1, 姚天華2, 趙小鴿3(西安交通大學(xué):1.口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面整形外科;2. 口腔醫(yī)學(xué)院中心實驗室, 陜西西安710004;3. 醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)實驗中心, 陜西西安710061摘要:目的觀察神經(jīng)生長因子(nerve growth factor , N GF 對離體培養(yǎng)條件下的人頭皮毛囊生長的影響。方法在離體人頭皮毛囊培養(yǎng)模型中, 加入100g L -1的N GF , 測量毛囊長度的變化以及24h DNA 合成率。結(jié)果目鏡測微器觀測100g L -1的N GF 與125mg L -1的米諾地爾一樣能明顯地促進游離的人頭皮毛囊生長(P &l

2、t;0. 05 , 尤以前8d 較為明顯; 3H 2TdR 摻入檢測的DNA 合成率亦明顯增高。結(jié)論100g L-1的N GF 對游離的人頭皮毛囊的生長有促進作用。文獻標(biāo)識碼:A文章編號:167128259(2004 0220127203E ffects of nerve grow th factor on human hair follicles in vit roTu J unbo , Yang Zhuangqun , Yao Tianhua , Zhao Xiaoge (Department of Oral and Maxillary Surgery , Stomatological C

3、ollege ofXi an Jiaotong University , Xi an 710004, China ABSTRACT :Objective To observe t he eff ects of nerve growt h f act or (N GF on growt h of human hair f ollicles in vitro. Methods N GF was added t o t he model of human hair f ollicles in vitro. The lengt h and t he DNA synt hesis rate of hum

4、an hair f ollicles in vitro were measured. Re sults We f ound bot h 100g L -1N GF and 125mg L-1minoxidil significantly accelerated t he growt h of human hair f ollicles in vitro (P <0. 05 , esp ecially in t hep revious 8days. The rate of incorp oration of 3H 2Td R was obviously higher t han t hat

5、 of t he cont rol.Conclusion N GF of 100g L-1significantly p romotes t he growt h of human hair f ollicles in vitro.KE Y WOR DS :hair f ollicle ; culture in vitro ; nerve growt h f act or (N GF 收稿日期:2003205230修回日期:2003209226基金項目:2002西安交通大學(xué)自然科學(xué)研究基金; 西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院青年科研基金(YQ2001203作者簡介:屠軍波(19722 , 男(漢族 , 主

6、治醫(yī)師, 在讀博士.含有色素毛發(fā)的生長需要上皮性成份、間質(zhì)性成份和神經(jīng)外胚層成份間精密的相互作用來完成。毛發(fā)與神經(jīng)從起源到分布都提示二者之間有著千絲萬縷的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)毛囊中有神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達, 體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)介質(zhì)對毛囊的生長有一定的影響, 特別是近年來基因剔除鼠和轉(zhuǎn)基因鼠的研究進一步提示毛囊的生長存在神經(jīng)調(diào)控機制。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor , N GF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子中有代表性的一種, 毛囊中也有其蛋白和受體的表達。我們構(gòu)建了游離的人頭皮毛囊器官培養(yǎng)模型, 觀察了N GF 對毛囊生長的影響。1材料與方法1. 1標(biāo)本來源整形外科除皺頭皮和神經(jīng)外科切口周

7、邊頭皮(年齡1845歲 。1. 2培養(yǎng)基與試劑配制的Williams E 無血清培養(yǎng)基(G iboco , 加入各成份的終濃度分別為:谷氨酰胺(Sigma 2mmol L-1,Hepes 2mmol L-1, 氫化可的松10g L -1, 轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma 10mg L -1, 亞硒酸鈉10g L -1, 牛胰島素(Sigma 10mg L -1, 青霉素10×104U L-1, 鏈霉素100mg L-1。N GF 與米諾地爾購于Sigma 公司; 3H 2TdR 購于北京原子能研究所。1. 3離體人頭皮毛囊培養(yǎng)參照Philpott1方法,在超凈工作臺中, 將頭皮于術(shù)后盡快取回,

8、 清洗消毒后剪成約0. 5cm 寬的皮條, 浸入Willams E 培養(yǎng)基中待分離。用眼科剪刀將皮條從真皮和皮下組織交界處剪開, 以顯微外科鑷順毛囊方向?qū)⒚遗c周圍組織鈍性分離, 輕輕夾住毛囊遠(yuǎn)端小心從皮下組織中倒拔毛囊。注意不要傷及毛乳頭和真皮組織鞘, 并小心去凈毛囊周圍的脂肪組織。解剖顯微鏡下選取完整無損傷的生長期毛囊進行培養(yǎng), 游離的毛囊小心移入24孔培養(yǎng)板中, 每孔1根毛囊, 加入0. 5mL Willams第25卷第2期2004年4月西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版J our nal of Xi an J iaot ong U niversity (Medical Sciences V ol

9、. 25N o. 2Ap r. 2004E 無血清培養(yǎng)基,37,50mL L -1(5% CO 2恒溫孵育箱中懸浮培養(yǎng)。24h 后選生長明顯的毛囊(0. 1mm 加入N GF 或米諾地爾繼續(xù)培養(yǎng), 無需換液。1. 4實驗分組我們共培養(yǎng)成功了約100根毛囊,隨機取72根毛囊, 分成3組, 每組24根。第一組為空白對照組, 單純毛囊培養(yǎng)組; 第二組為陽性對照組, 加入米諾地爾125mg L -1; 第三組為N GF 組, 加入的N GF 質(zhì)量濃度是100g L -1。1. 5毛囊形態(tài)觀察與長度測量每組隨機18根毛囊, 每天在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察毛乳頭、真皮組織鞘、內(nèi)皮根鞘、外皮根鞘及毛干的變化。每

10、天目鏡測微器測量毛囊長度。另外取部分正常培養(yǎng)的毛囊, 以冰凍包埋劑(OCT 包埋, -21下作10m 厚的冰凍切片,HE 染色。1. 63H 2TdR 摻入與測定每組6根毛囊, 加入3H 2TdR 使其終濃度為2mCi L-1, 繼續(xù)培養(yǎng)24h 。取出毛囊,0. 01mol L -1PBS 沖洗3遍, 置于閃爍杯中, 加入20mL L -1(2% 乙酸200L ,70水浴至毛囊全部溶解, 加入二氧六環(huán)閃爍劑6mL , 液閃記數(shù)。測量3遍, 取平均值。1. 7統(tǒng)計學(xué)處理生長長度用單側(cè)t 檢驗。2結(jié)果2. 1離體毛囊形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察毛干與內(nèi)外根鞘都有明顯的延長, 而結(jié)締組織鞘則無明顯變化(

11、圖1 。毛囊中毛干、內(nèi)皮根鞘、外皮根鞘和結(jié)締組織鞘各個層次清晰, 毛乳頭呈錐形嵌入毛母質(zhì)中。毛囊生長末期, 毛干與內(nèi)皮根鞘之間的界限開始模糊不清。毛球與毛干上移, 毛球形態(tài)不規(guī)則, 毛根變成杵狀(圖2 。冰凍切片結(jié)果觀察:冰凍切片HE 染色光鏡下觀察可見毛皮質(zhì)、毛小皮、內(nèi)皮根鞘、外皮根鞘及結(jié)締組織鞘等結(jié)構(gòu)。其中毛皮質(zhì)呈灰紫色, 下部可見黑素顆粒; 內(nèi)根鞘細(xì)胞胞漿呈深紅色; 外根鞘細(xì)胞為多層, 呈藍紫色; 結(jié)締組織鞘和毛乳頭呈淡紅色。生長快的毛囊外根鞘柱狀細(xì)胞層數(shù)較多, 胞核顏色較深, 毛乳頭體積較大(圖3 , 而生長慢的毛囊外根鞘細(xì)胞為淡藍色或淡紅色, 與內(nèi)根鞘及結(jié)締組織鞘的顏色相近, 部分毛

12、囊下段輕度彎曲(圖4 。圖1毛囊培養(yǎng)5d 時, 結(jié)締組織鞘無延長, 毛干與內(nèi)外根鞘等率延長Fig. 1The hair shaft and internal and external root sheath had e qual elongation when the hair follicles were cultured on day 5×40圖2毛囊培養(yǎng)9d 時, 毛根變成杵狀Fig. 2The hair root changed to pestl shape when the hair follicles were cultured on day 9×40圖3生長快

13、的毛囊外根鞘柱狀細(xì)胞胞核顏色較深, 毛乳頭體積較大Fig. 3The columnar cell nucleus of external root sheath in hair follicles which grew quickly were deep staining , and the papilla of hair were comparatively big ×40圖4生長慢的毛囊外根鞘細(xì)胞與內(nèi)根鞘及結(jié)締組織鞘的顏色相近, 部分毛囊下段輕度彎曲Fig. 4The staining of external root sheath , internal root sheath

14、and dermal root sheath were similar , and the inferior se gments of some hair follicle were lightly curvature ×402. 2離體毛囊生長長度如圖5所示, 目鏡測微器測量毛囊長度發(fā)現(xiàn):100g L -1的N GF 與125mg L-1的米諾地爾一樣對離體培養(yǎng)的人頭皮毛囊的生長有明顯的促進作用(P <0. 05 。2. 33H 2TdR 攝入率3H 2TdR 攝入量以毛囊c min -1(R 表示, 計算方法為:R =(每杯實測c min-1值-本底c min -1值 /每

15、杯毛囊數(shù)。如表1所示,N GF 組與米諾地爾組的3H 2TdR 攝821西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版第25卷入量明顯增加, 即24h 的DNA 合成率明顯增高。 圖5各組前8d 生長狀況Fig. 5The growth status of every group during the first 8days表1各組24h 3H 2TdR 攝入量Table1The rates of incorporation of 3H 2TdR (c min -1Group BackgroundNegative1422. 6672034. 0002509. 333R237. 11339. 00418. 223討論

16、在離體培養(yǎng)條件下, 我們通過目鏡測微器測量毛囊長度發(fā)現(xiàn)100g L -1的N GF 與125mg L -1的米諾地爾一樣對人頭皮毛囊有促生長作用。3H 2TdR 攝入實驗也說明N GF 與米諾地爾組的毛囊24h DNA 合成率明顯增高。實驗結(jié)果說明100g L -1的N GF 對游離的人頭皮毛囊的生長有促進作用。最初神經(jīng)營養(yǎng)因子是作為神經(jīng)發(fā)育調(diào)節(jié)劑被發(fā)現(xiàn)和鑒定的?，F(xiàn)在人們已熟知神經(jīng)營養(yǎng)因子有著更廣泛的功能。根據(jù)同源性大小, 基因表達部位和蛋白作用的專一性以及信號傳遞機制的不同, 可將神經(jīng)營養(yǎng)因子分為三個家族:神經(jīng)生長因子家族、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子家族和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族。神經(jīng)營養(yǎng)因子和它

17、們的受體在多種細(xì)胞中都有表達, 包括角朊細(xì)胞。有研究表明N GF 刺激角朊細(xì)胞增殖并且是角朊細(xì)胞的存活因子, 可能是通過保持抗凋亡原癌基因產(chǎn)物Bcl 22的相對水平來實現(xiàn)的2。近年來, 許多研究已表明神經(jīng)營養(yǎng)因子(主要是神經(jīng)生長因子家族和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子家族 在毛囊的生長發(fā)育中起著關(guān)鍵性的作用?！耙灰钩畎最^”與周圍神經(jīng)損傷患者相應(yīng)區(qū)域的毛囊萎縮現(xiàn)象提示神經(jīng)對毛囊的營養(yǎng)作用。動物實驗切除脊髓后根或周圍神經(jīng)后毛發(fā)生長受阻, 也佐證了上述觀點。小鼠的皮膚有3組水平走向的神經(jīng)叢:表皮下神經(jīng)叢、真皮下神經(jīng)叢和皮下組織神經(jīng)叢。其中真皮下神經(jīng)分出神經(jīng)纖維圍繞毛囊峽部形成毛囊峽部神經(jīng)網(wǎng)3。這又從組織形

18、態(tài)上證實神經(jīng)與毛囊的生長有密切的關(guān)系。毛囊既分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子又是神經(jīng)營養(yǎng)因子的靶器官。毛囊的神經(jīng)營養(yǎng)因子既有來自雪旺細(xì)胞和神經(jīng)旁分泌的, 也有來自毛囊本身自分泌的。在毛囊的形態(tài)發(fā)生中,N GF 、N T3、N T4和BDN F 都有表達。最近就有研究表明N GF mRNA 和它的翻譯產(chǎn)物在生長期羊毛囊中有表達, 位于增生的毛球部及其上方的分化細(xì)胞4。同時, 神經(jīng)營養(yǎng)因子的受體TrkA 、TrkB 、TrkC 和p75N GFR 在毛囊形態(tài)發(fā)生中也有表達。低親和力受體p75N GFR , 可結(jié)合N T3、N T4、BDN F 和N GF , 位于隆突部周圍間質(zhì)細(xì)胞和隆突部的下方。最近又發(fā)現(xiàn)p75

19、N GFR 信號途徑與退行期角朊細(xì)胞凋亡有關(guān)5,p75N GFR 剔除鼠的退行期也明顯遲緩6。在研究中又發(fā)現(xiàn), TrkA 在毛囊形態(tài)發(fā)生的各期表皮中都有表達, 而p75N GFR 則在7,8期毛囊中徹底消失7。因而可以推斷,N GF 控制毛囊形態(tài)發(fā)生后期可能是通過TrkA 信號通路起作用的?；蜓芯勘砻髅倚螒B(tài)發(fā)生中不僅表達N GF 和TrkA , 而且胚胎鼠過表達N GF 在轉(zhuǎn)基因鼠皮膚中可輕度加速毛囊的形態(tài)發(fā)生。N GF 基因剔除鼠表現(xiàn)出延緩毛發(fā)生長;N GF 缺乏鼠毛囊生長受限, 毛發(fā)周期縮短且毛囊過早進入退行期。而轉(zhuǎn)基因成鼠過表達N GF (在啟動子14作用下 則表現(xiàn)出加速退行期8。在

20、有毛皮片器官培養(yǎng)中,N GF 可顯著增加處在8期的毛囊比例。鼠皮片器官培養(yǎng)時N GF 刺激休止期毛囊的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖, 而對處于增殖期高峰(生長早期 的毛囊角質(zhì)形成細(xì)胞卻表現(xiàn)抑制作用9。這種相反的作用或許與細(xì)胞周期或細(xì)胞分化有關(guān)。臨床現(xiàn)象和實驗研究表明神經(jīng)對毛囊的作用機制可能有兩種:一是通過調(diào)控毛囊周圍的血管分布對毛囊營養(yǎng)進行調(diào)控; 另一種就是皮膚神經(jīng)通過分泌一些因子作用于毛囊, 從而調(diào)控毛囊的增殖、分化和凋亡8。我們的實驗結(jié)果說明100g L -1的N GF 對游離的人頭皮毛囊的生長有促進作用。在去除體液、神經(jīng)等其他影響因素的條件下, 證明N GF 對離體的人頭皮毛囊的促生長作用是直接的。

21、一方面可能是通過本身的受體通路直接刺激毛母質(zhì)細(xì)胞和外皮根鞘細(xì)胞增殖實現(xiàn)的, 另一方面可能是促進毛乳頭細(xì)胞分泌一些促上皮形態(tài)發(fā)生物質(zhì)和生長因子, 從而間接調(diào)節(jié)毛囊生長。具體的機制有待于進一步研究。(下轉(zhuǎn)第141頁增生, 基底膜增厚, 管腔狹窄甚至閉塞, 神經(jīng)的缺血缺氧已經(jīng)達到了相當(dāng)高的程度; 此時, 業(yè)已下降的NO 對血管功能的微弱調(diào)節(jié)不足以對神經(jīng)血供造成顯著的影響, 因而對神經(jīng)功能損害的加重不起主要作用。血管因素的其他方面及代謝因素8可能在DPN 的發(fā)展中占主導(dǎo)地位。有實驗表明, NO 供體或合成原料L 2arg 的補充, 可使神經(jīng)內(nèi)血流灌注有顯著性恢復(fù)。自由基清除劑也可通過減少自由基對NO

22、滅活改善神經(jīng)內(nèi)血流及神經(jīng)傳導(dǎo)速度。多項實驗研究的結(jié)果證實, 內(nèi)皮源性NO 的減少對神經(jīng)內(nèi)血流供應(yīng)有顯著影響, 說明NO 在糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生的血管機制中占重要地位。神經(jīng)血液供應(yīng)的減少導(dǎo)致神經(jīng)缺氧, 進而引起神經(jīng)營養(yǎng)受損、再生障礙。本研究通過檢測22DM 患者血清NO 水平, 對NO 與22DM 及DPN 的關(guān)系進行了初步探討, 發(fā)現(xiàn)22DM 患者血清NO 水平的變化是一個隨病程變化的過程。代謝紊亂的早期, 血清NO 顯著升高; 隨著病程的延長, 血清NO 逐漸下降; 至疾病中晚期, 血清NO 較正常人群顯著降低; 這種變化可能涉及到糖尿病血管病變的發(fā)生; 22DM 患者DPN 的發(fā)生與血清NO

23、 水平密切相關(guān);DPN 的發(fā)展與血清NO 無明顯關(guān)系。而DM 發(fā)生時NO 減少引起DPN 發(fā)生的具體機制尚待進一步研究。參考文獻:1Wascher TC , Graier W F , Ba hador B. Ti me course of endot helialdysf unction in diabetes mellitus J . Circulation ,1994, 90(2 :1109-1110.2Tolins TP. Abnor mal renal he mod yna mic resp onse t o reduced re 2nal perf usion p ressure i

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