抗氧化酶活性等測定方法

1、.葉綠體的提取一、試劑配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl（0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用時加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、懸浮液：將PBS提取液中的MES換為238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×

2、;0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；實際配制：PBS提取液2000ml(3個處理*2個品種*3個重復*20ml*3次=1080ml), 懸浮液100ml（3個處理*2個品種*3個重復*1ml*3次=54ml）; 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3個處理*2個品種*3個重復*3ml*3次=162ml）二、提取步驟1、10g鮮樣加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH

3、2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前現(xiàn)配現(xiàn)加）2、快速研磨，使葉片碎成綠豆粒大小，4層紗布過濾，去除殘渣（注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體膜破碎）3、濾液2000g3min，小心倒出上清液，將離心管放入離心機后，使離心機的加速很快上升到預定值(水平轉頭，加速度調到9)，約經30s后很快使其下降停止，整個離心持續(xù)大約2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面懸浮物；5、用1ml懸浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前現(xiàn)

4、配現(xiàn)加）將沉淀懸浮，在分散葉綠體時宜用毛筆輕輕刷，或者用手握住離心管在冰塊之間攪動，使葉綠體由于震動分散開來，不要用棉球吸濾，以防被膜壓破。葉綠體懸浮時要濃點，含葉綠素2mg.ml-1以上，這樣有利于保持活性。6、2000g 1min;7、沉淀再用懸浮液懸浮;(懸浮液同5，可以不做)8、用Percol試劑進行梯度離心（將3ml含有80%Percol（原液按100%算）鋪在10ml離心管下層，再把3ml 40%Percol鋪在離心管中層，然后將1ml葉綠體懸浮液輕輕鋪在離心管上層）1500g 2-3min（用水平離心頭的離心機，離心機加速要緩慢上升，加速度調到1），下降也要緩慢下降，否則會破碎P

5、ercol的濃度梯度層的形成，取出會看到3層綠色帶，最上層為破碎的葉綠體，沉在地層的為粗顆粒，40-80%的Percol之間的界面有一層綠色層為完整的葉綠體;9、小心吸出，轉移到懸浮介質中，使葉綠體濃度達到1mg.ml-1；（計算：取葉綠體懸浮液0.1ml，加4.9 ml 80%的丙酮，搖勻后于1000g離心2min，上清液置于1cm的比色杯，在625nm上比色，按照公式計算：OD625nm×50/34.5=葉綠素mg/ml）10、測定葉綠體的完整性，完整率達到85-95%；參考：Takeda K, Otaubo T,Konda N. Participation of hydroge

6、n peroxide in the inactivation of Calvin-cycle SH enzyme in so2-furmugated spinach leaves. Plant and cell Physiology,1982,23:1009-1018.取上述制備的完整葉綠體進行如下測定：1、 用50mM PBS（保護酶或其他測定項目的緩沖液）稀釋2-5倍，用于測定SOD、POD、CAT、APX；2、 用冷丙酮稀釋2倍，取0.5ML提取液用于測定H2O2；（本試驗中用0.2 mol/L HClO4稀釋）3、 用5%的TCA稀釋2-5倍，取1.5ml用于測定MDA；4、 用乙醇：

7、丙酮：水=4.5：4.5：1稀釋，用于測定葉綠素；抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性測定方法一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定（氮藍四唑光化還原法）1、試劑的配制（1）0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分別取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(N

8、aH2PO4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。參考文獻：李合生主編：植物生理生化實驗原理和技術.高等教育出版社，2000：267268。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸緩沖液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30M EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。（4）60M核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM 氮藍四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。（上述試劑先配好，放到4度冰箱，用之前臨時按下面的方法配，然后

9、放在4度冰箱中，不要在最上層，避免見光，第一組樣品加好后拿出來加，加完后放回冰箱，第二組的樣品加好后再拿出來加）酶液制備：取0.2g（可視情況調整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/L預冷的磷酸緩沖液（pH7.8）在冰浴上研磨成勻漿，轉入離心管中在4、12000g下離心20min，上清液即為酶液。2、酶活性測定（1）反應混合液配制(以60個樣為準)：分別取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml（加的量和前面的濃度要核對），磷酸緩沖液5.4ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；SOD反應混合液：3個處理*2個品種*3次重復*

10、3ml*3次測定=162ml(實際配置200ml)（2）分別取3ml反應混合液和30l（可視情況調整，最好先做一個濃度梯度，看加多少合適，如果量太少，最好稀釋后再加，這樣精確）酶液于試管中（盡可能加到試管的底部，要靠著試管壁打下去先加酶液，后加反應液，加好后搖一搖，看看試管上是不是有霧氣，最好拿紗布把試管下邊擦一下，免得霧氣擋住光線照過去）；（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應20min；（照光很重要，試管要選擇相同規(guī)格的，因為不同的試管透光率是不一樣的，試管架不要選擇遮光的，這個最好分組做，同時幾組做相互之間會遮光，每一組一個重復，就是每一組中都要有所有的處理，且都要有一

11、個最大管，處理多的話，把根和葉分開做，最大管放在中間）同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應混合液加入30l PBS（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調零。（4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調零后，避光測OD560(出現(xiàn)顏色即可測定)。（5）酶活性計算：SOD活性單位以抑制NBT光化還原50所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調整酶量）為1個酶活單位（u）。SOD總活性 ( Ack-AE )×V/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力SOD總活性/蛋白質含量SOD總活性以鮮重酶單位每克表示（

12、u/g FW）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；Ack為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入PBS的體積)；Vt為測定時的酶液用量（ml，30ul）；W為樣品鮮重（g，測定時應換算為葉綠體的質量mg）；蛋白質含量單位為mg/g。二、POD、CAT酶活性的測定粗酶液制備同SOD。1、 過氧化物酶（POD）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)：分別取A母液(Na2HPO4 ) 123ml和B母液(NaH2PO4 ) 877ml混勻即為1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；（2）反應混合液配制（以60個

13、樣為準）：取200ml PBS(0.2M，pH6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml 30的H2O2，混勻后保存于冰箱中備用。POD反應混合液：3個處理*2個品種*3次重復*3ml*3次測定=162ml(實際配置200ml, 0.076ml, 0.112ml)（3）樣品測定：取3ml反應液并加入30l酶液，以PBS為對照調零，而后測定OD470值（測定40秒）。（邊加樣邊測定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計算：以每min OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單

14、位（u）。POD=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)A470：為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體積（ml，30ul）。2、 過氧化氫酶（CAT）活性測定（1）試劑配制：0.15mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) 457.5 ml 和B母液(NaH2PO4) 292.5 ml混合后用蒸餾水定容至1000ml。（2）反應液配制：取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 3

15、0%的H2O2（原液）搖勻即可。CAT反應液：3個處理*2個品種*3次重復*3ml*3次測定=162ml(實際配置200 ml, 0.3092ml)（3）樣品測定：取3ml反應液加入0.1ml（可視情況調整）酶液，以PBS為對照調零，測定OD240（紫外）（測定40s）。（4）酶活性計算：以每min OD值減少0.01為1個酶活性單位（u）。CAT=A240×Vt /（W×Vs×0.01×t） (u/g min)A240：為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重(g)；t為反應時間(min)；Vt為提取酶液總體積（ml，1.6ml）；Vs為測定時取用酶液體

16、積（ml, 0.1ml）。三、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的測定（緩沖液為K）1、試劑配制（按50個樣計算）：（1）0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH7.0）的配制：（A）K2HPO4·3H2O：228.22×0.05×0.61=6.9607g（B）KH2PO4： 136.09×0.05×0.39=2.6538g，以上兩者混合起來用去離子水定容到1L。（2）0.1 mM EDTA-Na2：取0.01861g EDTA-Na2用PBS溶液定容到500ml（372.24 g/M×0.1mM×500m

17、l=0.01861 g）；（3）5 mM AsA：取0.044g抗壞血酸用PBS溶液定容到50ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，176.13g/M5mM×50ml=0.044 g）；（4）20mMH2O2：取0.2ml,30%H2O2用去離子水稀釋到100ml（30% H2O2為550g×30%/(34.01g/M×0.5L)=9.703M）。實際配置0.1 mM EDTA-Na2：3個處理*2個品種*3次重復*1.7ml*3次測定=91.8ml;（實際配置250 ml,0.009305g）5 mM的AsA: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配

18、置50 ml,0.044g）20mM H2O2: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配置50 ml,0.1ml）2、酶活性的測定（以2 ml體系測定）（1）取0.10 ml 酶液（可視情況調整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na2的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 20mM H2O2，立即在20下測定D290（紫外）值在40s內（測定時間內變化大可測定的時間短點，否則長點）的變化，計算單位時間內AsA減少量和酶活性（室溫下測定，緩沖液調零）。計算公式： OD/t

19、15;Vr×VTA×d×Vt×WOD為反應時間內吸光度的變化（40秒吸光度0秒吸光度）；t為反應時間（40秒）；Vr為反應液體積（2mL）；VT提取液體積（1.6mL）；A為消光系數(shù)（2.8mM-1.cm-1）；d為比色杯厚度（1cm）；Vt測定液體積（0.1mL）；W為樣品鮮重（0.2g）。四、超氧陰離子自由基（O2.-）產生速率的測定（羥胺氧化法）1、試劑的配制（1）1mM鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml；（2）17mM對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加熱溶

20、解后定容至400ml；（3）7mM-萘胺溶液：稱取0.4008g-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。實際配置PBS（0.05M，pH7.8）: 3個處理*2個品種*3次重復*0.5ml*3次測定=27ml;（實際配置100 ml）1mM鹽酸羥胺溶液: 3個處理*2個品種*3次重復*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100 ml,0.00695g）17mM對氨基苯磺酸: 3個處理*2個品種*3次重復*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100 ml,0.2944g）7mM-萘胺溶液：3個處理*2個品種*3次重復*1ml*3次測定=54ml;（實際配置100 ml

21、,0.1004g）2、O2.-含量的測定（1）樣品液提取方法同SOD測定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調整用量）中加入0.5ml PBS（0.05M，pH7.8），1ml 1mM鹽酸羥胺溶液后搖勻。（3）在25下保溫1小時；（4）依次先加入1ml 17mM對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mM -萘胺，混合后快速搖勻；（5）在25下保溫20min后在3000×g下離心3min后馬上進行測定（或置于冰箱待測）；（6）以對照管調零（用水調零），取粉紅色水相液測定OD530值（測定）；（7）O2.-含量的計算：由測得的OD530，查NO2-標準曲線得到NO2-；根據(jù)羥胺與O2.-

22、的反應式：NH2OH2O2.-H+NO2-H2O2 H2O 計算O2.-，即NO2-×2=O2.-；再根據(jù)樣品與羥胺反應的時間和樣品中的蛋白質含量，求得O2.-產生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鮮重表示）。O2.-產生速率=（C×V）/（t×W） （nmol min-1g-1鮮重）C為標準曲線上查得的濃度(umol/L)；V為測定時所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應時間(60min)；W為樣品鮮重(葉綠體實際質量g)參考文獻：王愛國，羅廣華植物生理學通訊，1990，（6）：5557五、可溶性蛋白含量的測定

23、（考馬斯亮藍染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍溶液配制：稱取100 mg考馬斯亮藍，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85（W/V）的磷酸，再用蒸餾水定容到1。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。（2）100g/ml牛血清蛋白（BSA）標準溶液：稱取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即為100g/ml標準BSA溶液）。實際配置0.05M，pH7.8磷酸緩沖液：3個處理*2個品種*3次重復*0.08ml*3次測定=0.3456ml;（實際配置100 ml,）考馬斯亮藍

24、溶液: 3個處理*2個品種*3次重復*2.9ml*3次測定=156.6ml; （實際配置200 ml，20mg）2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20l提取液（酶液）加入80l，0.05M，pH7.8磷酸緩沖液（即稀釋成0.1ml提取液），再加入2.9ml考馬斯亮藍溶液，反應2min后測OD595（以100l緩沖液加2.9ml考馬斯亮藍為對照調零）。（2）蛋白質含量計算：可溶性蛋白質含量（mg/g）=(C×VT)/(W×VS×1000)C為標準曲線查得的蛋白質含量（g）；VT為提取液總體積（稀釋后的體積ml）；VS為測定時所用提取液體積（

25、ml，20l）；W為樣品鮮重（g）。過氧化氫（H2O2）含量的測定一、試劑配制：1、0.2 mol/L HClO4：取10.05g HClO4溶解于0.5L的水中；2、4 mol/L KOH：取112 g KOH溶解于0.5L的水中；3、0.1 mol/L，pH 6.5的磷酸緩沖液：Na2HPO4·12H2O5.6407g+NaH2PO4·2H2O5.3433g用去離子水定容到500ml；4、顯色液：100mL、0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液+25 L N,N-二甲基苯胺+10 mg 4-氨基氨替吡啉；5、過氧化物酶溶液（250 U/mL）二、測定步驟：稱取植

26、株根和葉片組織各0.5g，分別置于研缽中，加入1.6 mL預冷至4的0.2 mol/L HClO4，冰浴勻漿，于10 000×g離心5 min（4），取上清液，加4 mol/L KOH調pH值為7.5后，再于10 000×g離心5 min（4），取上清液1 mL，加0.4 mL顯色液和0.1mL過氧化物酶溶液（250 U/mL），用島津UV-1601分光光度計測定波長550 nm（可見）處光密度值的變化，H2O2含量以mol/gFW表示。（用什么調零.）三、計算方法：（要做標線.）參考：過氧化氫（H2O2）含量的測定參照Uchida等(2002)方法并加以改進。還原型谷胱苷

27、肽GSH2 試劑配制（1）1mM GSH標準液10mL（現(xiàn)用現(xiàn)配）：稱3.0733mgGSH,加蒸餾水至10mL。(不要)（2）5磺基水楊酸500mL：25g溶于500mL水中。（3）6mM DTNB：稱取0.118905g DTNB溶于50mL PBS（0.1M，pH7.5）中。（4）2mM NADPH：18.1mg NADPH溶于10mL PBS中。（5）1mMGSSG標準液10mL：6.126mg GSSG加PBS至10mL。(不要)實際配置0.1M PBS(pH 7.5):3個處理*2個品種*3次重復*0.5ml*3次測定=27ml; （實際配置50 ml）6mM DTNB:3個處理*

28、2個品種*3次重復*0.2ml*3次測定=10.8ml; （實際配置50 ml，實際用量0.1189g）2mM NADPH: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3次測定=5.4ml;（實際配置50 ml, 實際用量18.1mg）(1U)GR: 3個處理*2個品種*3次重復*0.1ml*3次測定=5.4ml; （實際配置50 ml, 實際用量10ml）5磺基水楊酸：3個處理*2個品種*3次重復*0.01ml*3次測定=0.54ml;（實際配置10ml）(實際用量0.5g/10ml)0.5mM PBS: 3個處理*2個品種*3次重復*1.5ml*3次測定=81ml; （實際配置100 ml

29、）乙醚（二乙醚）: 3個處理*2個品種*3次重復*10ml*3次測定=540ml; （實際配置1000 ml）PBS Buffer 0.5mM: 3個處理*2個品種*3次重復*1.5ml*3次測定=81ml; （實際配置150 ml）2-乙烯吡啶:3個處理*2個品種*3次重復*0.2ml*3次測定=10.8ml; （實際用量20 ml）乙醚: 3個處理*2個品種*3次重復*10ml*3次測定=540ml; （實際用量1000 ml）1標線制作：配制濃度為0，0.02mM,0.04mM,0.06mM,0.08mM,0.1mM,0.12mM的標準GSH溶液（吸取上述標準液各0.1mL）加入0.5m

30、L 0.1M磷酸鈉Buffer（pH7.5）(含5mM EDTA)，0.2mL 6mM DTNB,0.1mL 2mM NADPH,0.1mL(1U)GR（谷胱甘肽還原酶）(sigma),從0.1mL GSH啟動反應，測定650s的A412（OD412），繪制標準曲線。以PBS代替DTNB作空白。3 GSH（還原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）（1）取1g新鮮葉片，加入10µL（可以取0.2g鮮樣，加1.6ml提取液）5磺基水楊酸，研磨后在14000g離心10分鐘，取1mL上清液，加入1.5mL,0.5mM PBS （pH7.5）中，再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（雜質會融到

31、乙醚層中，而乙醚處于整個反應體系得上層，你直接用槍吸取上層乙醚丟棄即可，反復進行兩次即為抽取兩次），此提取液用于分析總谷胱苷肽含量。各取1mL上清液，加入1.5mL PBS Buffer 0.5mM (pH7.5),0.2mL 2-乙烯吡啶（原裝試劑濃度）混合至乳膠狀，在25反應1小時，再用5mL乙醚（原裝試劑濃度）抽提2次，此提取液用于分析GSSGGSSG氧化型谷胱甘肽， GSH還原型谷胱甘肽不能夠直接測出，需測出氧化型和還原型谷胱甘肽含量，即總的谷胱甘肽含量，然后減去氧化型谷胱甘肽(GSSG）含量得到還原型谷胱甘肽含量（GSH）（2）取反應混合液（0.5mL 0.1M PBS(pH 7.5)(內含5mM ED