課題3　分解纖維素的微生物的分離 (3)

1、纖維素：棉花棉花是自然是自然界中纖維素界中纖維素含量最高的含量最高的天然產(chǎn)物；天然產(chǎn)物；纖維素是地球上含量最豐富的纖維素是地球上含量最豐富的多糖類多糖類物質(zhì)，植物物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過每年產(chǎn)生的纖維素超過7070億噸；分布植物的根、億噸；分布植物的根、莖、葉中；莖、葉中；1 1、在草食性動物等的消化道內(nèi)，也、在草食性動物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素共生有分解纖維素的微生物的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。而人沒有分解纖維素的能力。2 2、農(nóng)作物秸稈農(nóng)作物秸稈 等富等富含大量的纖維素，被利用的機會很少、效率低；

2、含大量的纖維素，被利用的機會很少、效率低； 纖維素生物燃料：纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源能分解纖維素的微生物有各種細菌、真菌和少數(shù)放線菌。細菌能分解纖維素的微生物有各種細菌、真菌和少數(shù)放線菌。細菌主要有纖維桿菌、纖維球菌、纖維弧菌和纖維粘菌等。主要有纖維桿菌、纖維球菌、纖維弧菌和纖維粘菌等。一、基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識纖維素酶纖維素酶纖維二糖纖維二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素 在在2支支20mL的試管中，分別放入的試管中，分別放入16cm的濾紙條，再分別加入的濾紙條，再分別加入pH為為4.8、物質(zhì)的量、物質(zhì)的量濃度為濃度

3、為0.1mol/L的的醋酸醋酸-醋酸鈉緩沖液醋酸鈉緩沖液10mL、11mL。在加入。在加入10mL緩沖液的試管中加入緩沖液的試管中加入1mL纖維素酶（纖維素酶（7080U/mL）。將二支試管）。將二支試管固定在固定在50mL的錐形瓶中，在搖床上以的錐形瓶中，在搖床上以140r/min的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)1h，觀察結(jié)果。，觀察結(jié)果。1U表示表示1個酶活力單位，是指在溫度為個酶活力單位，是指在溫度為25，其他反應(yīng)條件，其他反應(yīng)條件，如如pH等，均為最適的情況下，在等，均為最適的情況下，在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化內(nèi)轉(zhuǎn)化1mmol的底物所的底物所需的酶量。需的酶量。底物：酶所作用和催化的化合物。底物：酶

4、所作用和催化的化合物。 1號試管號試管2號試管號試管1cm*6cm濾紙濾紙條條+醋酸醋酸醋酸鈉緩醋酸鈉緩沖液沖液10ml11ml纖維素酶纖維素酶1ml_振蕩振蕩1h1h纖維素酶水解濾紙試驗纖維素酶水解濾紙試驗在一支試管中添加纖維素酶，在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；另一支試管不添加纖維素酶；思考思考1實驗分析：該實驗實驗分析：該實驗是如何構(gòu)成對照的？是如何構(gòu)成對照的？濾濾紙紙崩崩潰潰法法3.3.1、篩選纖維素分解菌的方法、篩選纖維素分解菌的方法_。該方法可以通過該方法可以通過_反應(yīng)直接篩選。反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法剛果紅染色法顏色顏色2、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成、

5、其原理是：剛果紅可以與纖維素形成_，當纖維素被，當纖維素被_分解后，分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以_為中心的為中心的_，可以通過，可以通過_ 來篩選纖維素分解菌。來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素酶纖維素分解菌纖維素分解菌 透明圈透明圈是否產(chǎn)生透明圈是否產(chǎn)生透明圈可根據(jù)是否可根據(jù)是否產(chǎn)生產(chǎn)生透明圈透明圈來篩選纖維來篩選纖維素分解菌素分解菌練一練：練一練：1.1.下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是下列關(guān)于纖維素酶的說法，錯誤的是A. 纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種纖維素酶是一種復(fù)合酶，至少包括三種B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把

6、纖維素分解成葡萄糖C. 纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解利用剛果紅法可以篩選出纖維素分解菌，下列說法錯誤的是菌，下列說法錯誤的是A. 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物 B. 剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物 C. 剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D. 若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌選出了纖維素分解菌二、二、實驗設(shè)計實

7、驗設(shè)計土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯度梯度稀釋稀釋將樣品涂將樣品涂布到布到鑒別鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么什么樣的樣的環(huán)境環(huán)境取樣取樣? 培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的特點特點? ?挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基的特點的特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?根據(jù)根據(jù)：微生物：微生物對生存環(huán)境的對生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)要求，到相應(yīng)環(huán)境中去找；環(huán)境中去找；目的：目的：增加纖維素增加纖維素分解菌的濃度，分解菌的濃度，以以確保能夠從樣品中確保能夠從樣品中分離到所需要的微分離到所需要的微生物；生物；剛果紅染色法剛果紅染色法1、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基

8、、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于屬于_（固體、液體）培（固體、液體）培養(yǎng)基，原因是養(yǎng)基，原因是_【資料二】選擇培養(yǎng)【資料二】選擇培養(yǎng)閱讀資料二閱讀資料二“選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基”，回答以下幾問題：，回答以下幾問題：液體液體沒有添加瓊脂沒有添加瓊脂2、該培養(yǎng)基對微生物、該培養(yǎng)基對微生物_（具有，不具有）選擇作用。（具有，不具有）選擇作用。如果具有，其選擇機制是如果具有，其選擇機制是_ 具有具有 以以纖維素粉為唯一纖維素粉為唯一碳源，能分碳源，能分解纖維素的微生物可以大量繁解纖維素的微生物可以大量繁殖；殖；若設(shè)置一個對照實驗說明選擇培養(yǎng)的作若設(shè)置一個對照實驗說明選擇培養(yǎng)的作用，應(yīng)控制的變量是將用，應(yīng)控制

9、的變量是將_改為改為_。3、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基、你能否設(shè)計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用？的作用？葡萄糖葡萄糖纖維素粉纖維素粉培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KH2PO4 0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g凝固劑凝固劑上述物質(zhì)溶解后，加蒸上述物質(zhì)溶解后，加蒸餾水定容至餾水定容至1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素鑒別鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉

10、)【資料三】剛果紅染色法【資料三】剛果紅染色法方法一：方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)色反應(yīng)方法二：方法二：在倒平板時就加入剛果紅在倒平板時就加入剛果紅染色法染色法優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點方法一方法一 方法二方法二 顏色反應(yīng)基本顏色反應(yīng)基本上是纖維素分上是纖維素分解菌的作用解菌的作用 操作繁瑣，剛操作繁瑣，剛果紅會使菌落之間果紅會使菌落之間發(fā)生混雜發(fā)生混雜操作簡便，操作簡便，不存在菌落不存在菌落混雜問題混雜問題 產(chǎn)生淀粉酶的產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊微生物也產(chǎn)生模糊透明圈，有些微生透明圈，有些微生物能降解色素，形物能降解色素，形成明顯的透明圈。成明顯的透

11、明圈。思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足思考：這兩種方法各有哪些優(yōu)點與不足挑選產(chǎn)生透明圈的菌落挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 挑取產(chǎn)生挑取產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，明顯的透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。一般即為分解纖維素的菌落。 接種到接種到纖維素分解菌的纖維素分解菌的選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在基上，在30300 0C C 37370 0C C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)。（一）復(fù)習(xí)微生物技術(shù)（一）復(fù)習(xí)微生物技術(shù)（二）選擇培養(yǎng)基的操作方法（二）選擇培養(yǎng)基的操作方法四、操作提示五、結(jié)果分析與評價五、結(jié)果分析與評價 1.1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇

12、培養(yǎng)基是否篩選出菌落出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。 為了確定分離得到的是纖維素分解菌，為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行還需要進行_實驗，纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。纖發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的維素所產(chǎn)生的_ _ 進行定量測定。進行定量測定。發(fā)

13、酵產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 液體液體 固體固體 六、課題延伸六、課題延伸分解分解纖維纖維素的素的微生微生物的物的分離分離纖維素酶纖維素酶種類、作用、催化種類、作用、催化剛果紅染色剛果紅染色篩選原理篩選原理實實驗驗設(shè)設(shè)計計土壤取樣土壤取樣選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)涂布培養(yǎng)涂布培養(yǎng)梯度稀釋梯度稀釋前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纖維素土壤富含纖維素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鑒別染色鑒別挑選菌落挑選菌落課堂總結(jié)課堂總結(jié)產(chǎn)生透明圈的菌落產(chǎn)生透明圈的菌落1 1、請回答下列與檢驗飲用水有關(guān)的問題：、請回答下列與檢驗飲用水有關(guān)的問題：（1 1）檢驗大腸桿菌的含量時，通常將水樣進行一）檢驗大腸桿菌