基于發(fā)光金納米粒子熒光增強(qiáng)法測定溶菌酶

1、基于發(fā)光金納米粒子熒光增強(qiáng)法測定溶菌酶    摘 要 參照文獻(xiàn)方法合成了BSA修飾的水溶性發(fā)光金納米粒子，并考察了其與溶菌酶之間的相互作用。依據(jù)溶菌酶對金納米粒子的發(fā)光增強(qiáng)現(xiàn)象，建立了測定溶菌酶的熒光新方法?？疾炝税l(fā)光金納米粒子的濃度、pH值、反應(yīng)時(shí)間及共存物質(zhì)對測定的影響。優(yōu)化條件為：發(fā)光金納米粒子濃度4.0 ×106 mol/L、反應(yīng)時(shí)間 10 min。在此條件下，熒光增強(qiáng)與溶菌酶濃度在2×1078×106 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為3.0×108 mol/L。對4.0 ×106 mo

2、l/L溶菌酶平行測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%。本方法具有靈敏度高、探針?biāo)苄院煤蜕锒拘缘偷膬?yōu)點(diǎn)，同時(shí)，常見低等電點(diǎn)蛋白質(zhì)對分析不干擾。本方法用于合成樣品及雞蛋清中溶菌酶含量測定，平均回收率為97.5%103.6%。 關(guān)鍵詞 溶菌酶； 發(fā)光金納米粒子； 熒光方法 1 引 言 溶菌酶是一種高等電點(diǎn)的酶, 廣泛存在于身體組織以及分泌物中。鳥類和家禽的蛋清、哺乳動(dòng)物的體液及微生物中也含有此酶, 其中蛋清中含量最豐富。溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、無毒性等優(yōu)點(diǎn), 并具有溶解一些細(xì)菌的特性。從雞蛋清中提取的溶菌酶還可以替代一些化學(xué)合成藥物， 用于食品防腐。此外，研究表明， 尿液和血清中溶菌酶的增加

3、會導(dǎo)致白血病，腎臟疾病和腦膜炎等。因此，溶菌酶已被廣泛應(yīng)用于生物工程和醫(yī)療領(lǐng)域。目前，有關(guān)溶菌酶的分析方法主要有動(dòng)態(tài)濁度法和溶板法。近年來， 高靈敏測定溶菌酶的熒光方法也有報(bào)道, 由于溶菌酶本身不具有熒光，一些外源探針，主要是CdSe2/CdS和CdSe以及CdHgTe等發(fā)光量子點(diǎn)被廣泛采用。 近年來，納米尺寸的貴金屬粒子由于其獨(dú)特的發(fā)光性能備受關(guān)注。與上述發(fā)光量子點(diǎn)相比，直徑小于5 nm的發(fā)光金納米粒子（Luminescent gold nanoparticles, GNPs） 具有制備簡單、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，尤其是低毒性探針可能更適合分析一些含生物酶的系統(tǒng)。目前，利用各種方法制備的GNP

4、s已被用于溶液中Hg2和Ni2的測定, 以及細(xì)胞成像分析。本研究將GNPs應(yīng)用于TX-100及其臨界膠束濃度的測定。 本研究參照文獻(xiàn)合成了牛血清蛋白（BSA）修飾的GNPs，并考察了它們與溶菌酶及其它常見蛋白質(zhì)的相互作用。結(jié)果表明, 隨著溶菌酶加入濃度的增加，GNPs的熒光明顯增強(qiáng)，而其它低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)對GNPs的熒光影響很小，據(jù)此建立測定溶菌酶的熒光方法，并用于雞蛋清樣品和含蛋白質(zhì)合成樣品中溶菌酶含量的測定，結(jié)果令人滿意。  2 實(shí)驗(yàn)部分 2.1 儀器與試劑 F-4500熒光分光光度計(jì)、U-3010紫外-可見分光光度計(jì) （日本 Hitachi公司）; JEOL-2010高分辨電鏡

5、 （HRTEM, 日本電子株式會社）； TGL-16C型高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）; pH酸度計(jì) （杭州東星儀器設(shè)備廠）; 85-1型磁力攪拌器 （江蘇金壇正基儀器有限公司）。牛血清白蛋白 （BSA，上海生物工程有限公司）; HAuCl44H2O （Sigma-Aldrich公司）; 溶菌酶 （Lysozyme Chloride，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）。0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）； 其它試劑均為分析純。水為二次蒸餾水。 2.2 實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1 GNPs的制備 將0.125 mL 1% HAuCl44H2O （m/V）稀釋至20 mL，加入 134 mg B

6、SA，劇烈攪拌 2 h，加入30.6 mg NaBH4， 繼續(xù)反應(yīng) 24 h，高速 （11000 r/min） 離心除去顆粒較大的粒子，保留淡黃色的溶液。 2.2.2 樣品處理與檢測 在一系列 10 mL具塞試管中分別加入0.4 mL GNPs溶液，0.5 mL 0.01 mol/L PBS緩沖液，然后加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)試劑溶液或樣品溶液，稀釋到5 mL，常溫下放置10 min后進(jìn)行熒光測定。測定在室溫 （20 ）下進(jìn)行，采用10 mm石英液池，激發(fā)波長為 320 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為10 nm，光電倍增管的負(fù)高壓為700 V。 實(shí)驗(yàn)用雞蛋樣品購于蕪湖當(dāng)?shù)厥袌?，將蛋清與蛋黃分開，用PBS緩

7、沖液（pH 7.0）將蛋清稀釋10倍。取適量上述樣品至GNPs溶液中，反應(yīng)10 min后進(jìn)行熒光測定。  3 結(jié)果與討論 3.1 發(fā)光金納米粒子的表征 由GNPs的透射電鏡圖（圖1）可見，合成的GNPs約5.1 nm，較均一。每個(gè)發(fā)光金納米粒子約包含100個(gè)小的金納米粒子。 圖1 發(fā)光金納米粒子的透射電鏡圖 Fig1 TEM image of luminescent gold nanoparticles （GNPs） 合成出的金納米粒子的熒光光譜見圖2。在320 nm紫外光激發(fā)時(shí)，在410 nm處有一半峰寬大約為70 nm的熒光發(fā)射峰，該峰的產(chǎn)生可能與金5d10帶和6（sp）1導(dǎo)帶之

8、間的電子躍遷有關(guān)。圖2還表明，在290 nm處有個(gè)很尖銳的紫外吸收峰，與文獻(xiàn)一致。以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)，測得此發(fā)光金納米粒子的熒光量子產(chǎn)率為0.053，證明制備的發(fā)光金納米粒子具有較高的熒光量子產(chǎn)率。 3.2 發(fā)光金納米與溶菌酶之間的作用 ，在pH 7.0的中性溶液中，GNPs和溶菌酶之間應(yīng)該存在較強(qiáng)的靜電作用。如圖3所示，隨著溶菌酶濃度的增加，GNPs的熒光強(qiáng)度逐漸增加。此現(xiàn)象可能是溶菌酶在GNPs表面因靜電作用形成了保護(hù)層，鈍化了GNPs的表面，從而使得GNPs的熒光逐漸增強(qiáng)。在向GNPs中加入其它一些低等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)時(shí)，GNPs的熒光基本不變；按照文獻(xiàn)合成的表面帶正電荷的發(fā)光金，在相同條件下

9、也未與溶菌酶之間發(fā)生明顯的相互作用而出現(xiàn)增敏現(xiàn)象。 圖2 BSA修飾的發(fā)光金納米粒子的紫外可見吸收光譜（a）和熒光光譜（b） Fig2 UV-vis absorption spectra （a） and fluorescence spectra （b） of BSA-modified gold nanoparticles 圖3 GNPs在不同濃度溶菌酶存在下的熒光光譜圖 Fig3 Fluorescence spectra of GNPs in the presence of different concentration of lysozyme 由18溶菌酶的濃度依次為（Concentrati

10、ons of lysozyme 18）： 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.5，2.5，3.5，4.5，6.0，8.0 SymbolmA mol/L。 由圖4可見，隨著NaCl濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定狀態(tài)。發(fā)光金納米粒子具有很好的穩(wěn)定性，即使在高濃度鹽溶液中也不會因自身團(tuán)聚而發(fā)生光譜改變。實(shí)驗(yàn)表明，GNPs和溶菌酶之間的確存在較強(qiáng)的靜電相互作用。圖5給出了加入溶菌酶前后熒光衰減曲線。當(dāng)向4.0×106 mol/L GNPs中加入8.0×106 mol/L溶菌酶時(shí)，熒光壽命從7.94 SymbolmA s增加到8.96 SymbolmA s，這進(jìn)

11、一步說明溶菌酶和GNPs之間的靜電作用可能使得GNPs表面鈍化，從而導(dǎo)致GNPs的熒光增強(qiáng)。 圖4 離子強(qiáng)度對體系熒光增敏的影響 Fig4 Effect of NaCl on the fluorescence enhancement of GNPs at 0. 01 mol/L pH 7 .0 PBS buffer Concentrations of lysozyme and GNPs were 3.0×106 ×106 mol/L, respectively. 圖5 熒光衰減曲線 Fig5 Fluorescence decay curves ex320 nm, em410

12、 nm. 3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 3.3.1 發(fā)光金納米粒子濃度選擇 實(shí)驗(yàn)表明，GNPs的熒光強(qiáng)度隨著其濃度的增加而增大。但GNPs濃度過大（5.0×105 mol/L，依據(jù)BSA濃度計(jì)算）時(shí)，會出現(xiàn)自猝滅現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度反而降低?？刂戚^低的GNPs的濃度，能降低熒光本底，對提高測定靈敏度有利。但過低的GNPs濃度，會導(dǎo)致發(fā)光不穩(wěn)定，也減小了測定溶菌酶的線性范圍。本實(shí)驗(yàn)GNPs濃度選擇4.0×106 mol/L。 3.3.2 酸度與介質(zhì)的影響 圖6給出在4.0×106 mol/L溶菌酶存在和不存在的條件下，pH值對發(fā)光金納米粒子熒光強(qiáng)度的影響。 圖6 在溶菌酶存在 （

13、F） 和不存在 （F0）條件下，pH值對發(fā)光金粒子熒光強(qiáng)度的影響 Fig6 Effect of pH on fluorescence intensity of GNPs in the presence （F） and absence （F0） of lysozyme GNPs和溶菌酶濃度均為4.0×106 mol/L（Both the concentration of lysozyme and GNPs were 4.0×106 mol/L）。發(fā)光金粒子本身在不同pH值熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的波動(dòng)，在pH11時(shí)強(qiáng)度較大，這與文獻(xiàn)一致，可能是不同pH值時(shí)發(fā)光金的表面態(tài)不同所致。最大

14、的熒光增強(qiáng)出現(xiàn)在pH 7.0附近，在此酸度下，溶菌酶帶有較高的正電荷。而Zeta電勢實(shí)驗(yàn)表明，此條件下發(fā)光金粒子表面帶有較高的負(fù)電荷（數(shù)據(jù)未列出），二者間強(qiáng)的靜電相互作用可能有效地導(dǎo)致了發(fā)光金表面鈍化，并增強(qiáng)其熒光發(fā)射。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0的PBS緩沖溶液控制反應(yīng)的酸度。 3.3.3 反應(yīng)時(shí)間的影響 考察了反應(yīng)時(shí)間對溶菌酶測定的影響。結(jié)果表明，試劑混合后， 熒光逐漸增強(qiáng)； 反應(yīng)10 min后，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大,并在隨后的20 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)10 min后進(jìn)行熒光測定。 3.4 干擾實(shí)驗(yàn) 混合體系中發(fā)光金的濃度4.0×106 mol/L，溶菌酶的濃度為6&

15、#215;107 mol/L，考察了可能共存的物質(zhì)對測定的影響。結(jié)果表明，以相對熒光強(qiáng)度變化±5%計(jì)，共存組分允許存在的濃度見表1。1000倍的維生素C、維生素B、維生素E；800倍半胱氨酸、高半胱氨酸、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、小牛胸腺DNA、葡萄糖、多巴胺；500倍人血清蛋白、卵白蛋白、伴白蛋白、卵粘蛋白、血紅素、肌紅球素；一些重金屬離子，如Ni2， Cu2， Hg2， Ag，在10倍情況下對體系的熒光有一定的猝滅作用，而同等濃度的高等電點(diǎn)的細(xì)胞色素C對體系有明顯的增加作用。但它們在實(shí)際樣品中含量大多較低，一般不會對測定產(chǎn)生影響。 在最佳條件下，GNPs的

16、熒光強(qiáng)度與溶菌酶的濃度在2×1078×106 mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。FF0Lys（106 mol/L），線性相關(guān)系數(shù)R0.996，檢出限為3.0×108 mol/L。對4.0×106 mol/L溶菌酶平行測定6次，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%?？梢姳痉椒ň哂休^高的分析靈敏度和重現(xiàn)性。 3.6 合成樣品和實(shí)際樣品的測定 采用本法測定了實(shí)際蛋清樣品中溶菌酶的含量，結(jié)果見表2。回收率為97%104%，溶菌酶含量在4655 mol/L范圍，與文獻(xiàn)基本一致?？紤]到溶菌酶在其它一些實(shí)際應(yīng)用體系中可能含有一定的蛋白質(zhì)及其它共存物質(zhì)，考察了3種合成樣品中溶菌酶的含量（

17、表3），測定的相對誤差均小于 SymbolqB 5%，表明本方法適用于其它實(shí)際樣品中溶菌酶含量的測定。 References 1 Chen Y M, Yu C J, Cheng T L, Tseng W L. Langmuir, 2008, 24（7）： 36543660 2 Pellegrino L, Tirelli A . Int. Dairy J., 2000, 10（7）： 435442 3 Lee Y C, Yang D . Anal.Biochem., 2002, 310（2）： 223224 4 Chang H M, Yang C C, Chang Y C . J. Agric.

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26、, biological engineering, and especially in food antisepsis to replace chemically synthesized ones. Therefore, the development of a simple analytical method for lysozyme assay is very important. Here, water-soluble BSA-modified fluorescent gold nanoparticles （GNPs） were prepared according to the literature, and their interaction with lysozyme was investigated. A novel fluorescence method for the determination of lysozyme has been developed based on the enhancement effect of lysozyme on the fluorescence of GNPs. The effects of GNPs