拉莫三嗪對(duì)圍生期缺氧導(dǎo)致驚厥的新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

1、拉莫三嗪對(duì)圍生期缺氧導(dǎo)致驚厥的新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用         11-03-25 11:54:00     編輯：studa20                      作者：王明歡，鄧燕，蔣犁，何農(nóng)躍【摘要】  目的:探討拉莫三嗪(LTG)對(duì)圍生期缺

2、氧導(dǎo)致驚厥的新生大鼠(生后10 d)的神經(jīng)保護(hù)作用。方法：新生大鼠隨機(jī)分成缺氧生理鹽水組、缺氧LTG組、常氧生理鹽水組和常氧LTG組4組。缺氧生理鹽水組(n=26)：用梯度缺氧方法制作急性缺氧模型(氧濃度低于4%)，缺氧前0.5 h已腹腔注射生理鹽水;缺氧LTG組(n=26)：腹腔注射LTG(20 mg·kg-1)，0.5 h后放入同上的缺氧裝置;常氧生理鹽水組(n=26)：腹腔注射生理鹽水后放入常氧濃度的相同裝置;常氧LTG組(n=26)：腹腔注射LTG后放入同上的常氧濃度裝置。尼氏染色評(píng)估驚厥發(fā)作1 h后及生后30 d大鼠的細(xì)胞丟失情況，Timm染色觀察生后30 d大鼠的苔蘚纖維

3、發(fā)芽情況，戊四氮測(cè)量生后30 d大鼠的驚厥敏感性。結(jié)果：尼氏染色結(jié)果顯示各組大鼠在驚厥發(fā)作1 h及生后30 d的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見明顯神經(jīng)元丟失。缺氧LTG組在圍生期缺氧驚厥的程度及敏感性與缺氧生理鹽水組無明顯差異，常氧兩組均未見驚厥發(fā)作。但在生后30 d，缺氧LTG組大鼠對(duì)戊四氮的驚厥閾值較缺氧生理鹽水組明顯增高(P<0.05)，較常氧組降低(P<0.01)，常氧兩組間無差異(P>0.05)。缺氧LTG組大鼠在生后30 d時(shí)，齒狀回顆粒上層的苔蘚纖維發(fā)芽分?jǐn)?shù)較缺氧生理鹽水組明顯降低(P<0.05)，但與常氧兩組間均無明顯差異。結(jié)論：拉莫三嗪對(duì)圍生期缺氧導(dǎo)致驚厥的大鼠有神

4、經(jīng)保護(hù)作用，降低了大鼠對(duì)化學(xué)致癇藥物的敏感性，并且阻止了遠(yuǎn)期發(fā)展為癲癇的可能。 【關(guān)鍵詞】  拉莫三嗪; 新生大鼠; 缺氧; 驚厥; 神經(jīng)保護(hù)作用; 苔蘚纖維發(fā)芽Neuroprotective effects of lamotrigine on neonatal rats afterAbstract Objective: To investigate the possible neuroprotective effects of lamotrigine(LTG) on neonatal rats after hypoxiainduced seizures at postnatal d

5、ay 10. Methods: Four groups of rats were studied at postnatal day 10. Rats in hypoxianormal saline(NS) group(n=26) were subjected to acute hypoxia at postnatal day 10 according to the protocol of progressively decreasing oxygen(down to 4% O2) and intraperitoneally injected with NS half hour before h

6、ypoxia. Rats in hypoxiaLTG group(n=26) were subjected to acute hypoxia and received LTG(20 mg·kg-1) intraperitoneally half hour before hypoxia. Rats in normoxiaNS group(n=26) were injected with NS and placed in normal oxygen apparatus. NormoxiaLTG group(n=26) were injected with LTG and placed i

7、n normal oxygen apparatus. Nissl staining was performed to evaluate cell loss at one hour after onset of seizure and at postnatal day 30. Timm staining was performed to evaluate mossy fiber sprouting and seizure susceptibility was tested by pentylenetetrazol( PTZ) at postnatal day 30. Results: Nissl

8、 staining showed that there was no obvious neuronal loss after seizure induction at either postnatal day 10 or postnatal day 30 in all groups. The degree of seizure and seizure susceptibility of rats in hypoxiaLTG group was similar to that in hypoxiaNS group. The seizure threshold induced by PTZ of

9、the rats in hypoxiaLTG group was significantly higher than that in hypoxiaNS group(P<0.05) and lower than that in the two normoxia groups at postnatal day 30(P<0.01).There was no obvious difference between the two normoxia groups(P>0.05). Timm staining showed that supragranular zone of the

10、dentate gyrus in hypoxiaLTG group was lower than that in hypoxiaNS group(P<0.05), but there was no obvious difference in the two normoxia groups at postnatal day 30. Conclusions: These results suggest that the potential neuroprotective effect of lamotrigine in these particular animal model of per

11、inatal hypoxiainduced seizures. LTG decreased the longterm seizure susceptibility induced by chemical convulsant and prevented the later development of epilepsy.Key words lamotrigine; neonatal rats; hypoxia; seizure; neuroprotective effects; mossy fiber sprouting圍產(chǎn)期缺氧是新生兒驚厥和新生兒腦病最常見的原因，對(duì)兒童的神經(jīng)發(fā)育有潛在的長(zhǎng)

12、期影響，包括輕微的行為異常、嚴(yán)重的抽搐、智力發(fā)育遲滯和腦性麻痹等1。新生兒缺氧也是導(dǎo)致慢性癲癇的一個(gè)危險(xiǎn)因素。而且，新生兒缺氧合并驚厥會(huì)使驚厥持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，甚至可能導(dǎo)致常規(guī)的抗驚厥治療藥物無效2。目前常用的抗癇藥物，如巴比妥類、苯妥英那、苯二氮卓類，對(duì)發(fā)育腦都有副作用，所以我們需要尋找一種有效的、耐受性好、副作用少的新型抗癇藥物來替代3。拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)是一種新型抗癲癇藥，有效應(yīng)用于成人全身強(qiáng)直陣攣性抽搐，也用來輔助治療癲癇或是作為單一的抗癇治療藥物。但國(guó)內(nèi)外對(duì)LTG在新生期的應(yīng)用鮮有研究，LTG對(duì)圍生期缺氧驚厥大鼠的作用尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)制作了新生期缺氧性腦病模型，觀

13、察LTG是否可以降低缺氧驚厥新生大鼠的驚厥敏感性及從一定程度上阻止向癲癇發(fā)展的可能，是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 動(dòng)物模型制作和分組10日齡同窩SD大鼠104只，雌雄不限，體質(zhì)量1418 g，由復(fù)旦大學(xué)提供鼠種，東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖。大鼠隨機(jī)分成缺氧生理鹽水組、缺氧LTG組、常氧生理鹽水組和常氧LTG組4組。缺氧生理鹽水組(n=26)：新生大鼠在缺氧前0.5 h預(yù)先腹腔注射生理鹽水0.1 ml，然后根據(jù)逐步梯度降低氧濃度的方法造成急性缺氧的模型(在密閉裝置中依次通入7%氧濃度8 min,7%6%的氧濃度2 min 30 s,6%氧濃度4 min,6%5%氧濃度3 min

14、 40 s,5%氧濃度2 min,5%4%氧濃度5 min,4%氧濃度1 min4);缺氧LTG組(n=26)：同上方法制作急性缺氧模型，缺氧前0.5 h已腹腔注射LTG(20 mg·kg-1);常氧生理鹽水組(n=26)：腹腔注射等量生理鹽水后放入常氧濃度的相同裝置;常氧LTG組(n=26)：腹腔注射等量LTG后放入同上的常氧濃度裝置。1.2 方法1.2.1 藥物驚厥易感性測(cè)定生后30 d，分別給予各組8只大鼠每隔5 min腹腔注射致癇藥戊四氮(PTZ)(Sigma公司)10 mg·kg-1,直至出現(xiàn)第1次后沖性肌陣攣的發(fā)作,即肌陣攣導(dǎo)致頭和肩向后抽動(dòng)5。記錄出現(xiàn)第1次后

15、沖性肌陣攣或全身性陣攣發(fā)作所需的時(shí)間(即潛伏期)及注射的藥物總劑量。1.2.2 組織切片制備及染色1.2.2.1 切片制備 (1) 石蠟切片：造模后1 h及生后30 d,分別予各組6只大鼠2%戊巴比妥過量麻醉,左心室插管灌注4%多聚甲醛固定取腦，然后繼續(xù)用4%多聚甲醛后固定12 h后取海馬部位的腦組織常規(guī)石蠟包埋，在視交叉后1 mm處做冠狀切片，用作尼氏染色。(2) 冰凍切片：生后30 d,分別予各組6只大鼠2%戊巴比妥過量麻醉,先后灌注0.4%硫化鈉,2%多聚甲醛和1.5%戊二醛混合液固定取腦，再用4%多聚甲醛后固定24 h，最后置于30%的蔗糖溶液中過夜,待鼠腦沉底后，在海馬部位做冠狀冰凍

16、連續(xù)切片,切片厚30 m，用作Timm染色。1.2.2.2 尼氏染色 取石蠟切片，脫蠟后入二甲苯溶液3 min,然后依次浸入100%、95%、70%的酒精各3 min，蒸餾水浸洗3 min，然后入1%的甲苯胺藍(lán)染色610 min，最后蒸餾水沖洗,梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。1.2.2.3 Timm染色 將冰凍切片自然晾干,三蒸水沖洗，然后放入預(yù)先配制的混合液中(該混合液含有50%阿拉伯樹膠120 ml、5.78%氫醌60 ml、51%檸檬酸10 ml、47%檸檬酸鈉10 ml),染色前將17%硝酸銀溶液1.4 ml放入上述混合液中，置于黑暗處孵育4060 min,流水沖洗15 mi

17、n終止染色。切片自然晾干后,梯度酒精脫水、透明、封片。半定量評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照苔蘚纖維出芽分級(jí)表進(jìn)行,觀察CA3區(qū)和齒狀回顆粒細(xì)胞上層苔蘚纖維發(fā)芽的情況。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行成組設(shè)計(jì)的單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 行為學(xué)觀察生后10 d新生大鼠被放入7%氧濃度的密閉裝置約2 min后均出現(xiàn)了機(jī)械性咀嚼、點(diǎn)頭，然后進(jìn)展為呼吸困難、嘶叫及狂奔，全部達(dá)到了Lado評(píng)分的3.5級(jí)以上的驚厥發(fā)作，放回常氧環(huán)境中約2 min左右完全停止驚厥發(fā)作。缺氧生理鹽水組與缺氧LTG組驚厥發(fā)作的程度及潛伏期沒有明顯差異

18、(P>0.05)。放入缺氧裝置的所有大鼠均未死亡，常氧裝置中的新生大鼠均未有驚厥發(fā)作，亦無死亡。2.2 藥物驚厥閾值生后30 d的各組大鼠經(jīng)PTZ誘發(fā)后均出現(xiàn)驚厥發(fā)作。PTZ誘發(fā)驚厥的用量為5080 mg·kg-1，缺氧LTG組為(58.57±3.77) mg·kg-1，缺氧生理鹽水組為(52.50±4.62) mg·kg-1,常氧LTG組為(68.75±6.40) mg·kg-1，常氧生理鹽水組為(66.25±5.17) mg·kg-1，缺氧生理鹽水組大鼠引出驚厥發(fā)作的藥物劑量最小，除了常氧兩組間無差異，其余各組間均有明顯差異(P<0.05)。出現(xiàn)肌陣攣抽動(dòng)的平均潛伏期在缺氧LTG組為(27.14±1.57)分，缺氧生理鹽水組為(24.12&