分子生物基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)(續(xù))

1、分子生物基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)（續(xù)）（一）測序反應(yīng)： 1. 對于每組測序反應(yīng)，標(biāo)記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4備用。 2. 對于每組四個測序反應(yīng),在一個eppendorf管中混合以下試劑： （1） 樣品反應(yīng)： 質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液 5ml 引物 4.5pmol 無菌ddH2O 至終體積16ml （2）對照反應(yīng) pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml 5×測序緩沖液 5ml pUC/M13正向引物

2、(4.5pmol) 3.6ml 無菌ddH2 O 至終體積 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內(nèi)。5. 在微量離心機(jī)中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。6. 把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95的熱循環(huán)儀，以注意中循環(huán)模式為基準(zhǔn)，開始循環(huán)程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。 7. 熱循環(huán)程序完成后，在每個小管內(nèi)加入3l DNA測序終止溶液，在微量離心機(jī)中

3、略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。注意 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板種類/長度 模板量 200bp (PCR產(chǎn)物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋質(zhì)粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。 2、計算與4.5pmol相當(dāng)?shù)囊锛{克數(shù)可用以下一般公式： 4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數(shù) 計算與1pmol相當(dāng)?shù)囊镂⒖藬?shù)可用以下一般公式： dsDNA:1pmol=(6.6×

4、;10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數(shù) ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數(shù) 3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。 模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50% 95 2分鐘。然后： 95 30秒(變性), 42 30秒(退火), 70 1分鐘(延伸)。 模式2:適用于24堿基或略短的GC含量50%的引物。95 2分鐘, 然后: 95 30秒(變性), 70 30秒(退火

5、/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4保存過夜。 （二）、 測序凝膠板的制備1、玻璃板的處理： 銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠化學(xué)交聯(lián)于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。 （1）短玻璃板的處理 A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。 B. 用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細(xì)清洗過并已經(jīng)自然干燥的玻璃

6、板, 整個板面都必須擦拭。 C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。 注意 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。2. 準(zhǔn)備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導(dǎo)致凝膠撕裂。(2)、長玻璃板的處理 A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。 B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 注意 1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或

7、塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗?；蛘吣z用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現(xiàn)交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。 2、凝膠的制備： （1）玻璃板經(jīng)粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側(cè)，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。（2）根據(jù)所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結(jié)果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×

8、TBE緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。 凝膠終濃度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0

9、10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。 注意 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。 2、灌制凝膠的過程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則影響測序的結(jié)果。 （三）電泳： 1、預(yù)電泳 （

10、1）當(dāng)凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。 （2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。 （3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準(zhǔn)備預(yù)電泳。 （4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應(yīng)先將水浴加熱至55后進(jìn)行預(yù)電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產(chǎn)生的熱進(jìn)行保溫，如上海求精有機(jī)玻璃儀器生產(chǎn)的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。 （5）按3

11、0V/cm的電壓預(yù)電泳20-30分鐘。預(yù)電泳的過程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時使凝膠板達(dá)到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響測序的結(jié)果。 注意 （1）. 用鯊魚齒梳制作加樣孔時，應(yīng)注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果。 （2）. 應(yīng)時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。 2、樣品的制備：當(dāng)在預(yù)電泳時，即可進(jìn)行樣品的制備，將反應(yīng)完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長時間不用，則應(yīng)重新處理?？墒褂?-6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小于0.4mm的膠可能導(dǎo)致信號太弱。加

12、樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍(lán)色樣品。 3、上樣及電泳 關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時擴(kuò)散出來的尿素，然后立即用毛細(xì)管進(jìn)樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進(jìn)行電泳，5分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒壓狀態(tài)。一般來說，一個55cm長，0.2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態(tài)下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩(wěn)定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。 注意 1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達(dá)到55左右，如果還沒有達(dá)

13、到，則應(yīng)等溫度達(dá)到后才能上樣電泳。 2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因?yàn)樘叩碾妷簳鼓z的分辨率降低，并且使帶擴(kuò)散。電泳中可進(jìn)行恒功率電泳。 （四）、 測序凝膠的銀染染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。 1. 電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在短玻璃板上。 2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振蕩)。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應(yīng)。 3. 洗膠：用超純水振蕩洗膠3次，

14、每次2分鐘。從水中取出, 當(dāng)轉(zhuǎn)移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。 4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鐘。 5. 凝膠顯影： (1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400l)以完成顯影液的配制。 (2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時間不能長于5-10秒。浸泡時間過長則導(dǎo)致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復(fù)第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻將凝膠轉(zhuǎn)移至1升(總量的一半)預(yù)冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續(xù)顯影2

15、-3分鐘,或直至所有條帶出現(xiàn)。 6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應(yīng),固定凝膠。 7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 注意測序產(chǎn)物的銀染是顯現(xiàn)序列信息的一種新方法，本系統(tǒng)的成敗受幾個因素的影響。 1. 水的質(zhì)量對于染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質(zhì), 則低分子量條帶可能無法出現(xiàn)。

16、 2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學(xué)學(xué)會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結(jié)果。 3. 染色后的洗滌步驟是非常關(guān)鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產(chǎn)生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進(jìn)行。 4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯酰胺濃度高于4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應(yīng)后的洗滌必須縮短至不超過5秒。 5. 在室溫下進(jìn)行所有步驟，顯影反應(yīng)除外。顯影溶液必須預(yù)冷至10

17、-12以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復(fù)使用任何溶液。 （五）、EDF膠片顯影 使用EDF膠片可增強(qiáng)測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉(zhuǎn)移至EDF膠片之后可增強(qiáng)條帶可讀性。 1. 在暗室內(nèi)，將染色過的粘于玻璃板的凝膠(膠面向上)置于熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間, 用一小條EDF膠片曝光不同時間, 檢查不同的曝光強(qiáng)度, 一般曝光20-40秒可得較好結(jié)果。 2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角, 然后把膠片置于凝膠上，使缺口位于左上角。由于EDF膠片是單

18、面的，因此必須確保缺口在左上角。 3. 在EDF膠片上放置一干凈、干燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。 4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程: a. 在Kodak GBX顯影液中顯影1-5分鐘; b. 水洗1分鐘; c. 在Kodak GBX定影液中定影3分鐘; d. 水洗1分鐘. 注意 1. 進(jìn)行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全干燥。戴手套進(jìn)行操作, 以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。 2. 對于不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。 3. 曝光時間短則EDF膠片影像較

19、深，曝光時間長則有助于減弱背景。 （一）測序反應(yīng)： 1. 對于每組測序反應(yīng)，標(biāo)記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4備用。 2. 對于每組四個測序反應(yīng),在一個eppendorf管中混合以下試劑： （1） 樣品反應(yīng)： 質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液 5ml 引物 4.5pmol 無菌ddH2O 至終體積16ml （2）對照反應(yīng) pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg) 4.0ml 5×測序緩沖液 5ml pUC/M13

20、正向引物(4.5pmol) 3.6ml 無菌ddH2 O 至終體積 16 ml 3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內(nèi)。5. 在微量離心機(jī)中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。6. 把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95的熱循環(huán)儀，以注意中循環(huán)模式為基準(zhǔn)，開始循環(huán)程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。 7. 熱循環(huán)程序完成后，在每個小管內(nèi)加入3l DNA測序終止溶液，在微量

21、離心機(jī)中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。注意 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入： 模板種類/長度 模板量 200bp (PCR產(chǎn)物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋質(zhì)粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。 2、計算與4.5pmol相當(dāng)?shù)囊锛{克數(shù)可用以下一般公式： 4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數(shù) 計算與1pmol相當(dāng)?shù)囊镂⒖藬?shù)可用以下一般公式： dsDNA:1pmol=(6.6&

22、#215;10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數(shù) ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數(shù) 3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。 模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50% 95 2分鐘。然后： 95 30秒(變性), 42 30秒(退火), 70 1分鐘(延伸)。 模式2:適用于24堿基或略短的GC含量50%的引物。95 2分鐘, 然后: 95 30秒(變性), 70 30

23、秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4保存過夜。 （二）、 測序凝膠板的制備1、玻璃板的處理： 銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠化學(xué)交聯(lián)于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。 （1）短玻璃板的處理 A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。 B. 用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細(xì)清洗過并已經(jīng)自然干

24、燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。 C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。 注意 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。2. 準(zhǔn)備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。 3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導(dǎo)致凝膠撕裂。(2)、長玻璃板的處理 A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。 B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 注意 1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃

25、須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗?；蛘吣z用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現(xiàn)交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。 2、凝膠的制備： （1）玻璃板經(jīng)粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側(cè)，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側(cè)插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。（2）根據(jù)所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結(jié)果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10&#

26、215;TBE緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。 凝膠終濃度 3 4 5 6 8 12 16 18 尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0 10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 1

27、0.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0 10%過硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7 TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40 (3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。 注意 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。 2、灌制凝膠的過程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則影響測序的結(jié)果。 （三）電泳： 1、預(yù)

28、電泳 （1）當(dāng)凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。 （2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。 （3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產(chǎn)生的氣泡，接上電源準(zhǔn)備預(yù)電泳。 （4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應(yīng)先將水浴加熱至55后進(jìn)行預(yù)電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產(chǎn)生的熱進(jìn)行保溫，如上海求精有機(jī)玻璃儀器生產(chǎn)的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。 （

29、5）按30V/cm的電壓預(yù)電泳20-30分鐘。預(yù)電泳的過程是去除凝膠的雜質(zhì)離子，同時使凝膠板達(dá)到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區(qū)形成的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響測序的結(jié)果。 注意 （1）. 用鯊魚齒梳制作加樣孔時，應(yīng)注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結(jié)果。 （2）. 應(yīng)時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。 2、樣品的制備：當(dāng)在預(yù)電泳時，即可進(jìn)行樣品的制備，將反應(yīng)完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長時間不用，則應(yīng)重新處理?？墒褂?-6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小于0.4mm的膠可能導(dǎo)致信號

30、太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍(lán)色樣品。 3、上樣及電泳 關(guān)閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預(yù)電泳時擴(kuò)散出來的尿素，然后立即用毛細(xì)管進(jìn)樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進(jìn)行電泳，5分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒壓狀態(tài)。一般來說，一個55cm長，0.2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態(tài)下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩(wěn)定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。 注意 1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達(dá)到55左右，如果

31、還沒有達(dá)到，則應(yīng)等溫度達(dá)到后才能上樣電泳。 2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因?yàn)樘叩碾妷簳鼓z的分辨率降低，并且使帶擴(kuò)散。電泳中可進(jìn)行恒功率電泳。 （四）、 測序凝膠的銀染染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質(zhì)量的水洗滌盤子。 1. 電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應(yīng)該牢固地附著在短玻璃板上。 2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振蕩)。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應(yīng)。 3. 洗膠：用超純水振蕩洗

32、膠3次，每次2分鐘。從水中取出, 當(dāng)轉(zhuǎn)移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。 4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鐘。 5. 凝膠顯影： (1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400l)以完成顯影液的配制。 (2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉(zhuǎn)移到顯影溶液的總時間不能長于5-10秒。浸泡時間過長則導(dǎo)致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復(fù)第五步用染色液浸泡。 (3). 立刻將凝膠轉(zhuǎn)移至1升(總量的一半)預(yù)冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現(xiàn)或開始出現(xiàn)第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼

33、續(xù)顯影2-3分鐘,或直至所有條帶出現(xiàn)。 6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應(yīng),固定凝膠。 7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 注意測序產(chǎn)物的銀染是顯現(xiàn)序列信息的一種新方法，本系統(tǒng)的成敗受幾個因素的影響。 1. 水的質(zhì)量對于染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得較好的效果, 如果水中有雜質(zhì), 則低分子量條帶可能無

34、法出現(xiàn)。 2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學(xué)學(xué)會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結(jié)果。 3. 染色后的洗滌步驟是非常關(guān)鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產(chǎn)生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進(jìn)行。 4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯酰胺濃度高于4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4mm薄，染色反應(yīng)后的洗滌必須縮短至不超過5秒。 5. 在室溫下進(jìn)行所有步驟，顯影反應(yīng)除外。顯影溶液必須預(yù)

35、冷至10-12以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復(fù)使用任何溶液。 （五）、EDF膠片顯影 使用EDF膠片可增強(qiáng)測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉(zhuǎn)移至EDF膠片之后可增強(qiáng)條帶可讀性。 1. 在暗室內(nèi)，將染色過的粘于玻璃板的凝膠(膠面向上)置于熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間, 用一小條EDF膠片曝光不同時間, 檢查不同的曝光強(qiáng)度, 一般曝光20-40秒可得較好結(jié)果。 2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角, 然后把膠片置于凝膠上，使缺口位于左上角。由于EDF

36、膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。 3. 在EDF膠片上放置一干凈、干燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。 4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程: a. 在Kodak GBX顯影液中顯影1-5分鐘; b. 水洗1分鐘; c. 在Kodak GBX定影液中定影3分鐘; d. 水洗1分鐘. 注意 1. 進(jìn)行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全干燥。戴手套進(jìn)行操作, 以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。 2. 對于不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。 3. 曝光時間短則EDF膠

37、片影像較深，曝光時間長則有助于減弱背景。 第二節(jié) T7 DNA聚合酶測序技術(shù) 一、概述 T7 DNA聚合酶最初具有5'3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'5'外切酶活性。當(dāng)T7 DNA聚合酶用適當(dāng)方法處理后，可使3'5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。 使用T7測序酶得到的測序數(shù)據(jù)具有在每個堿基位置都有相對均勻的配對參入。因此, 放射自顯影所得到的結(jié)果較為清晰易辯, 對于許多模板來說, 使用含有dGTP的混合物即可得到理想的測序結(jié)果。然而, 如果出現(xiàn)了帶壓縮的問題，則用含dITP的混合物來取代常規(guī)的dGTP。dITP的摻

38、入，使在富含GC的模板中也能有效地消除帶壓縮現(xiàn)象。 T7測序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續(xù)性，正因如此，該酶在使用中不同于Klenow片段和反轉(zhuǎn)錄酶。它幾乎沒有錯誤性的終止，整個反應(yīng)在很短的時間內(nèi)完成，并且不需要進(jìn)行追加反應(yīng)(Chase step)。 然而對于有緊密二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域, 錯誤的終止反應(yīng)會給閱讀序列帶來困難。如果碰到這些情況，應(yīng)使用一些高溫DNA聚合酶，如Promega公司的測序級Taq DNA 酶。利用高溫DNA聚合酶獨(dú)有的耐熱特性，測序反應(yīng)可在不利于形成二級結(jié)構(gòu)的高溫條件下進(jìn)行。 T7 DNA聚合酶測序的快速而簡便的方法是從Klenow酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶測序的操作步驟修改而

39、來的，它的最大優(yōu)點(diǎn)是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和極低的3'-5'端外切酶的活性。在測序過程中，若以同位素標(biāo)記則相對于大腸桿菌DNA聚合酶的大片段Klenow，或反轉(zhuǎn)錄酶AMV而言，則可使條帶非常的均一，并且它的放射性背景極低。 T7 DNA聚合酶測序時DNA的合成的過程是分二步完成的。第一步為標(biāo)記反應(yīng)階段，第二步方為雙脫氧鏈末端終止的DNA合成過程。在第一步過程中，引物的延伸是在較低濃度的脫氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反應(yīng)過程中，已含有經(jīng)放射性標(biāo)記的dATP。第二步過程中，脫氧三磷酸核苷酸濃度提高，并且加入雙脫氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成過程

40、中，因加入的雙脫氧三磷酸核苷酸而隨機(jī)終止，形成長短不一的DNA片段。 二、材料 待測的DNA模板，可用雙鏈或單鏈模板。 三、設(shè)備 高壓電泳儀，測序用電泳槽，照相顯影用大號塑料盆，制膠設(shè)備，吹風(fēng)機(jī)，放射自顯影盒，X-光片。 四、試劑 1、5×T7 DNA聚合酶緩沖液：200mmol/L Tris·Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。 2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。 3、DTT ： 0.1mol/L。 4、5×常規(guī)標(biāo)記混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5m

41、mol/L dTTP。 5、5×dITP標(biāo)記混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。 6、dNTP A溶液（適用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCL。 7、ddG終止混合物 (適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddGTP。 8、ddA終止混合物 (適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddATP。 9、ddT終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8

42、mmol/L ddTTP。 10、ddC 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddCTP。 11、dNTP B溶液（適用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCl。 12、ddG終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。 13、ddA 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。 14、ddT 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L d

43、dTTP。 15、dd C終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。 16、測序用T7 DNA測序酶。 17、酶稀釋緩沖液：10mmol/L Tris·HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。 18、終止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯蘭 。 19、a-32PdATP 或a-35S-dATP, 35S的優(yōu)點(diǎn)是可使條帶為窄而清晰，并且操作更為安全。放射強(qiáng)度為：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。20、TE緩沖液：10mmol/L Tris-

44、HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。21、上節(jié)所述的凝膠制備過程中的全套試劑。22、X光顯影液：H2O：50 800ml，米吐爾 2.2g，無水Na2SO3 72g，對苯二酚 8.8g，無水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml備用。 23、F-5堅膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉狀鉀礬 15g ，定容至1000ml 備用。 24、TYP肉汁培養(yǎng)基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。25、20%PEG/3

45、.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）儲備液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac儲備液等體積混合。 五、操作步驟： （一）、模板制備 1、M13單鏈模板制備：在轉(zhuǎn)化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG的培養(yǎng)基上鋪板之后, 含有M13重組子的細(xì)胞將表現(xiàn)出無色的"噬菌斑"，事實(shí)上受感染的細(xì)胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現(xiàn)噬菌斑是因?yàn)楸桓腥镜募?xì)菌在生長速度上比其周圍未感染的細(xì)菌慢的緣故, 從無色噬菌斑上得到的感染細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)便能產(chǎn)生測序反應(yīng)所需的單鏈模板。 （1）過夜培養(yǎng)的宿主細(xì)胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培

46、養(yǎng)基以1:100稀釋。在37強(qiáng)烈震蕩1小時之后, 細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)早期。此時, 將一個合適的含有重組M13的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉(zhuǎn)入該細(xì)胞培養(yǎng)液中。（2）37強(qiáng)烈震蕩(300rpm) 培養(yǎng)6小時。 （3）把細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入兩只1.5ml eppendorf管, 12000g離心15分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管再離心15分鐘。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀), 再轉(zhuǎn)到新的eppendorf管。 . （4）將0.25體積的含20PEG(-8000)的3.75M醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體?；靹蚝笾帽?0分鐘, 再以12000g離心15分鐘, 傾去上清液

47、, 再以同樣方法離心一次, 用吸液器尖頭將殘留的PEG充分吸干凈。此時應(yīng)能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。 （5）將沉淀物重溶于400ml TE緩沖液中。 （6）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強(qiáng)烈震蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。 （7）將水相轉(zhuǎn)入一新的eppendorf管, 注意不能觸動原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿(1:1)混合液, 強(qiáng)烈振蕩1分鐘, 12000g離心5分鐘。 （8）將上層水相轉(zhuǎn)入另一新的eppendorf管, 重復(fù)第7步的提取, 如有必要重復(fù)多次直至二相之間無可見物質(zhì)存在。 （9）將上層水相轉(zhuǎn)入一新的eppendorf管, 加等體積氯仿, 強(qiáng)烈振蕩1

48、分鐘后, 12000g離心5分鐘, 多次重復(fù)此步驟。 （10）將上層水相轉(zhuǎn)入新的eppendorf管, 加0.5倍體積的7.5 mol/L 醋酸銨, 2倍體積乙醇, 混勻后-20放置 30分鐘。 （11）12000g離心15分鐘, 去除上清液, 用70乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被攪起, 重新離心, 傾去酒精, 真空干燥沉淀物。 （12）將DNA的沉淀物溶解于20ml去離子水中，取2ml樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳定量, 如果DNA量充足, 則可進(jìn)行退火測序。2、噬粒(Phagemid)單鏈模板的制備：噬粒是指含有絲狀單鏈DNA噬菌體復(fù)制區(qū)的嵌合質(zhì)粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和p

49、GEM系列的質(zhì)粒均屬噬粒。含重組噬粒的細(xì)胞單菌落經(jīng)液體培養(yǎng)并用輔助噬菌體超感染后就能產(chǎn)生測序反應(yīng)所需的單鏈DNA模板。 （1）從新鮮平板上挑得含pGEM質(zhì)粒DNA的抗Amp單菌落, 并接種到100ml含有50mg/ml氨芐的TYP肉湯培養(yǎng)基中, 在37振蕩過夜。 （2）取100ml過夜培養(yǎng)物接種到另一新的裝有5ml 含50mg/mlAmp的TYP肉汁培養(yǎng)基的試管中, 在37強(qiáng)烈振蕩30分鐘。 （3）加40l輔助噬菌體R408或M13 K07, 繼續(xù)劇烈攪拌振蕩培養(yǎng)6-8小時，使輔助噬菌體超感染。 （4）12000g離心15分鐘后，去除沉淀，取上清，轉(zhuǎn)移到一新eppendorf管中再次離心15分

50、鐘, 小心地取1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀)。 （5）將0.25體積的含20 PEG-的3.75M醋酸銨加入上清液以沉淀噬菌體顆粒?；靹蚝笾帽?0分鐘, 再以12000g離心15分鐘, 傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用移液器尖頭將殘留的PEG溶液吸凈。此時應(yīng)能看到管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。 （6）將沉淀物溶解于400ml TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。 （7）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強(qiáng)烈振蕩1分鐘, 再以12000g離心5分鐘。 （8）將水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管(不要觸動原管中兩相交

51、界面), 加等體積酚/氯仿(1:1)混合液, 強(qiáng)烈振蕩1分鐘, 12000g離心5分鐘。 （9）上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管重復(fù)第8步驟提取, 如有必要重復(fù)多次直至二相之間無可見物質(zhì)。 （10）將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管加等體積氯仿, 強(qiáng)烈振蕩1分鐘后離心, 多次重復(fù)此步驟。 （11）將上層水相轉(zhuǎn)入一干凈eppendorf管加0.5倍體積7.5mol/L pH7.5醋酸銨, 再加2倍體積乙醇, 混和后-20放置30分鐘。 （12）12000g離心15分鐘, 去除上清液, 用70乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被攪起,重新離心, 傾去乙醇, 真空干燥沉淀。 （13）將沉淀物溶

52、解于20ml去離子水中, 取2ml樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行定量，如果DNA量充足，則進(jìn)行退火和測序。 3、質(zhì)粒膜板制備：參照第一章所述的方法。（二）超螺旋質(zhì)粒DNA的堿變性：1、取4mg（約2pmol）超螺旋質(zhì)粒DNA至一eppendorf管中，加無離子水到終體積18ml。 2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室溫(25下）保溫5分鐘。 3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)渦旋混勻，使之中和。 4、加75ml無水乙醇，充分混勻后，置于干冰或-70沉淀10分鐘。 5、于12000g離心10分鐘，棄去上清，用200ml預(yù)冷的70%乙醇洗

53、沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml無離子水中。（三）、測序反應(yīng)：1、引物和模板的退火： （1）在一離心管中，混合如下幾種試劑： 引物 約1-2pmol 5×T7 DNA聚合酶測序反應(yīng)緩沖液 2ml DNA 約1mg 加ddH2O終體積至10ml 。 （2）將試管蓋蓋上后，65 加熱2分鐘，然后在大約30分鐘左右的時間內(nèi)，使試管的溫度緩慢地降到室溫。降溫的過程中可使用小的加熱板或小型的保溫儀，也可使用已調(diào)至65的水浴，使它們的溫度在室溫下緩慢地降至室溫即可。當(dāng)溫度降至30以下時，退火結(jié)束?？蓪⑿≡嚬苤糜诒?，退火完畢的模板須在4小時內(nèi)使用。 2、標(biāo)記反應(yīng) （1）在一個標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)過程中（從引物處開始，可讀到500個堿基以上），首先需要按1:5稀釋標(biāo)記混合物。如4ml 混合物則加雙蒸無離子水16ml。該稀釋液儲存在 -20可使用數(shù)周