09TI66101微生物限檢查法一部檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、1. 目的：建立微生物限度檢查法(一部)檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并按規(guī)程進(jìn)行檢驗，保證檢驗操作規(guī)范化。2. 依據(jù)： 2.1. 中華人民共和國藥典2010年版一部。3. 范圍：適用于所有用微生物限度檢查法(一部)測定的供試品。4. 責(zé)任：檢驗員、質(zhì)量控制科主任、質(zhì)量管理部經(jīng)理對本規(guī)程負(fù)責(zé)。5. 正文：5.1. 簡述：. 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。. 微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。防止污染的措施不得影響供試

2、品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗證。. 供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物無毒性。. 除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌及控制菌培養(yǎng)溫度為3035，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328。. 檢驗結(jié)果告以1g、1ml、10g、10ml或10cm2為單位報告，特殊品種可以最小包裝單位報告。5.2. 檢驗量。. 檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或 cm2）。. 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10 g或10ml；膜劑為100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的

3、檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。. 檢驗時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。5.2.4. 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。5.3. 供試液的制備。. 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。. 除另有規(guī)定外，常用的供試液制備方法如下。5.3.2.1. 液體供試品：取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨

4、緩沖液至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。5.3.2.2. 固體、半固體或黏稠性供試品：取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1：10的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。5.3.2.3. 需用特殊方法制備供試液的供試品。5.3.2.3.1. 非水溶性供試品。5.3.2.3.1.1. 方法1：取供試品5g(或5ml)，加至含溶化的（溫度不超過45）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚

5、山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20的供試液。5.3.2.3.1.2. 方法2：取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（制法見附錄B無菌檢查法中供試品的無菌檢查項下）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml，振搖510分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為1：10的供試液。5.3.2.3.2. 膜劑供試品：取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-

6、蛋白胨緩沖液100ml（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1：10的供試液。5.3.2.3.3. 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品：取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑) pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液。5.3.2.3.4. 氣霧劑、噴霧劑供試品：取規(guī)定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）

7、中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。5.3.2.3.5. 貼膏劑供試品：取規(guī)定量供試品，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯 80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少 30 分鐘，制成供試液。貼膏劑也可采用其他適宜的方法制備成供試液。5.3.2.3.6. 具抑菌活性的供試品：當(dāng)供試品有抑菌活性時，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。5.3.2.3.6.1. 培養(yǎng)基稀釋法：取規(guī)定量的供

8、試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時， 取同稀釋級的供試液2ml ，每1ml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。5.3.2.3.6.2. 離心沉淀法：取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。5.3.2.3.6.3. 薄膜過濾法：見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)項下的“薄膜過濾法”。5.3.2.3.6.4. 中和法：凡含

9、汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。5.4. 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)。. 計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。 . 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。. 菌種。. 試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（

10、B） 26 003 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501 白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001 黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F） 98 003. 菌液制備。. 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2448 小時。上述培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 50100cfu 的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面

11、培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 57 天，加入 35ml 含 0.05（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含 0.05（ml/ml）聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含孢子數(shù) 50100cfu 的孢子懸液。. 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用，若保存在 28，可在 24 小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在 28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。. 適用性檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各 50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻，凝

12、固，置3035培養(yǎng) 48小時，計數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉各 50100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備 2 個平皿，混勻，凝固，置 2328培養(yǎng) 72 小時，計數(shù)；取白色念珠菌 50100cfu， 注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備 2 個平皿， 混勻，凝固，置 2328培養(yǎng) 72 小時，計數(shù)。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。. 結(jié)果判定：若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。. 計數(shù)方法的驗證。. 當(dāng)建

13、立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。. 驗證時，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對各試驗菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗證。. 菌種及菌液制備。. 同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。. 驗證方法：驗證試驗至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。5.4.8.1. 試驗組：平皿法計數(shù)時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平

14、行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。薄膜過濾法計數(shù)時，取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。5.4.8.2. 菌液組：測定所加的試驗菌數(shù)。5.4.8.3. 供試品對照組：取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。5.4.8.4. 稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。試驗時，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50100cfu ，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方

15、法測定其菌數(shù)。. 結(jié)果判斷. 在 3 次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%。若試驗組的菌數(shù)回收率（試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%，照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法（常見干擾物的中和劑或滅活方法見表 1）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。表 1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊

16、二醛亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物稀釋法醛類稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯汞類制劑亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物卵磷脂碘酒、洗必泰類聚山梨酯鹵化物硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（EDTA）鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸ß-內(nèi)酰胺類抗生素ß-內(nèi)酰胺酶. 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌活性，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響

17、檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進(jìn)行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢驗。. 計數(shù)方法驗證時，采用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進(jìn)行供試品的檢驗。. 驗證試驗也可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。 . 供試品檢查。 . 簡述。. 計數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測定。 . 按計數(shù)方法的驗證試驗確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成 110、1102、1103 等稀釋級的供試液。.

18、 方法。5.4.10.2.1. 平皿法。5.4.10.2.1.1. 根據(jù)菌落報告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級的供試液 1ml，置直徑 90mm 的無菌平皿中，注入 1520ml 溫度不超過 45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備 2 個平板。5.4.10.2.1.2. 陰性對照試驗：取試驗用的稀釋液 1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備 2 個平板，均不得有菌生長。5.4.10.2.1.3. 培養(yǎng)和計數(shù)。5.4.10.2.1.3.1. 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng) 3 天，霉菌、酵母菌培

19、養(yǎng) 5 天。逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，必要時，可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至 7 天進(jìn)行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平板的菌落平均數(shù)不小于 15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。5.4.10.2.1.3.2. 一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細(xì)菌，則應(yīng)分別點計霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰

20、紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結(jié)果。5.4.10.2.1.3.3. 含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測定酵母菌數(shù)，合并計數(shù)。5.4.10.2.1.4. 菌數(shù)報告規(guī)則。 5.4.10.2.1.4.1. 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告 1g、1ml 或 10cm2 供試品中所含的菌數(shù)。5.4.10.2.

21、1.4.2. 如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于 1 時，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。5.4.10.2.2. 薄膜過濾法。5.4.10.2.2.1. 采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m，直徑一般為 50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗

22、液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超過 100ml，總沖洗量不得超過 1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。5.4.10.2.2.2. 取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml 或 10cm2 供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每 1g、1ml 或 10cm2所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液 1ml 進(jìn)行試驗。用 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計數(shù)方法的驗證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培

23、養(yǎng)基至少制備一張濾膜。5.4.10.2.2.3. 陰性對照試驗：取試驗用的稀釋液 1ml 照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。5.4.10.2.2.4. 培養(yǎng)和計數(shù)：培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。5.4.10.2.2.5. 菌數(shù)報告規(guī)則。5.4.10.2.2.5.1. 以相當(dāng)于 1g、1ml或10cm2 供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以<1 報告菌數(shù)（每張濾膜過濾 1g、1ml 或 10cm2供試品），或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。5.5. 控制菌檢查。. 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查。 . 控制菌檢查用的

24、培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。. 菌種：對試驗菌種的要求同計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B） 64 941 白色念珠菌（Candida

25、 albicans）CMCC（F） 98 001. 菌液制備。. 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml 含菌數(shù)為 10100cfu的菌懸液。. 菌懸液在室溫下放置應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用，若保存在 28可在 24 小時內(nèi)使用。. 適用性檢查：控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示能力的檢查。各培養(yǎng)基的檢測項目及所

26、用的菌株見表 2 。表 2 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長、抑制和指示能力檢查控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 大腸埃希菌大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 大腸埃希菌沙門菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 膽鹽硫乳瓊脂或沙門、志賀氏屬瓊脂 培養(yǎng)基 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康

27、凱脂培養(yǎng)基瓊?cè)氰F瓊脂培養(yǎng)基促生長能力促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力指示能力乙型副傷寒沙門菌 乙型副傷寒沙門菌 金黃色葡萄球菌 乙型副傷寒沙門菌 乙型副傷寒沙門菌 乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基 溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基 卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示能力抑制能力金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培

28、養(yǎng)基哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基促生長能力促生長能力生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基 1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示能力促生長能力+指示能力抑制能力促生長能力+指示能力白色念珠菌 白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌白色念珠菌. 液體培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于 100cfu 的試驗菌（見表 2）于被培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。. 固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗菌各 0.1ml（含菌數(shù) 50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對

29、照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。. 培養(yǎng)基抑制能力檢查：接種不少于100cfu的試驗菌（見表 2）于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。. 固體培養(yǎng)基指示能力檢查：取試驗菌各 0.1ml（含菌數(shù)不大于100cfu）（見表 2）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。. 液體培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種不大于 100cfu 的試驗菌（見表 2）

30、于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌生長情況、指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。. 控制菌檢查方法的驗證。 . 當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的控制菌檢查。若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，檢查方法應(yīng)重新驗證。. 驗證時，依各品種項下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。. 菌種及菌液制備：同控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性

31、檢查。 . 驗證方法：取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。. 結(jié)果判斷。. 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。. 驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行。. 供試品檢查：供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進(jìn)行。. 陽性對照試驗：陽性對照試驗方法同

32、供試品進(jìn)行控制菌檢查，對照菌的加菌量為 10100cfu。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。. 陰性對照試驗：取稀釋液 10ml 照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。 陰性對照應(yīng)無菌生長。5.5.17. 大腸埃希菌（Escherichia coli）。7.1. 取供試液 10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于 100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824 小時，必要時可延長至48小時。7.2. 取上述培養(yǎng)物 0.2ml，接種至含5mlMUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24 小時在 366nm 紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照

33、。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。7.3. 如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如 MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如 MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性，或 MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 1824 小時。7.4. 若平板上無菌落生長或生長的菌落與表 3 所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長的菌落

34、與表 3 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表 3 大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤8. 大腸菌群（Coliform）。8.1. 取含適量（不少于 10ml）的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管 3 支，分別加入 110 的供試液 1ml（含供試品 0.1g 或 0.1ml）、1100的供試液 1ml（含供試品 0.01

35、g 或 0.01ml）、11000 的供試液 1ml（含供試品0.001g 或 0.001ml），另取 1 支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對照管。培養(yǎng) 1824 小時。8.2. 乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。8.3. 若平板上無菌落生長，或生長的菌落與表 4 所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與表 4 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗。表

36、4 大腸菌群菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤8.4. 確證試驗。 8.4.1. 從上述分離平板上挑選 45 個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng) 2448 小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。8.4.2. 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表 5 報告 1g 或 1ml 供試品中的大腸菌群數(shù)。表 5 可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌落數(shù)N （個/g 或 ml）0.1g 或 0.1ml0.01g

37、 或 0.01ml0.001g 或0.001ml+-+-+-103102N10310N10210注：+ 代表檢出大腸菌群；- 代表未檢出大腸菌群。9. 沙門菌（Salmonella）。9.1. 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于 200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng) 1824 小時。9.2. 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于 10ml 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 1824 小時（必要時延長至4048 小時）。若平板上無菌落生

38、長或生長的菌落不同于表 6 所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。9.3. 若平板上生長的菌落與表 6 所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23 個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培 養(yǎng) 1824 小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為沙門菌。表 6 沙門菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明

39、，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色5.5.20. 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。5.5.20.1. 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824 小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 1824 小時。5.5.20.2. 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍(lán)綠色素擴(kuò)散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板生長

40、的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選 23 個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 1824 小時。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。5.5.20.3. 氧化酶試驗5.5.20.3.1. 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的 1二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。 5.5.20.3.2. 若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗。5.5.20.4. 綠膿菌素（Pyocyanin）試驗。5.5.20.4.1. 取

41、斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加三氯甲烷 35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入 1mol/L 鹽酸試液約 1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應(yīng)呈陰性。5.5.20.4.2. 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。5.5.21. 金黃色葡萄球菌（Staph

42、ylococcus aureus）。5.5.21.1. 取供試液 10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于 100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 1824 小時，必要時可延長至48小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng) 2472 小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于表 7 所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表 7 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌 落 形 態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)，菌落直徑 0.71mm卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起

43、，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑 12mm5.5.21.2. 若平板上生長的菌落與表 7 所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選 23 個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824 小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824 小時，作血漿凝固酶試驗。5.5.21.2.1. 血漿凝固酶試驗：取滅菌小試管 3 支，各加入血漿和無菌水混合液（11）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或

44、 0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將 3 管同時培養(yǎng)，3 小時后開始觀察直至 24 小時。陰性對照管的血漿應(yīng)流動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗管血漿凝固為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。5.5.21.2.2. 若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。5.5.22. 梭菌（Clostridium）。 5.5.22.1. 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2）2 份， 其中 1 份置 80保溫 10 分鐘后迅速冷卻。上述 2 份供試液直

45、接或處理后分別接種至 100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下培養(yǎng) 48 小時。取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng) 4872 小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應(yīng)挑選 23 個菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。5.5.22.2. 過氧化氫酶試驗。5.5.22.2.1. 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。5.5.22.2.2. 若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌，否則

46、判供試品未檢出梭菌。5.5.23. 白色念珠菌（Candida albicans）。 5.5.23.1. 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品 1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于 100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 4872 小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 2448 小時（必要時延長至72 小時）。5.5.23.2. 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表 面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白 色念珠菌。如

47、平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選 23 個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 2448 小時（必要時延長至72 小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。5.5.23.3. 若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 2448 小時。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗。5.5.23.4. 芽管試驗。5.5.23.4.1. 挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置3537、13 小時，置顯微鏡下觀察，孢子上有否長出短小芽

48、管。5.5.23.4.2. 若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。5.6. 結(jié)果判斷。 . 供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。. 供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨立復(fù)試兩次，以 3 次結(jié)果的平均值報告菌數(shù)。. 若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)、控制菌三項檢驗結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。5.7. 稀釋液。稀釋液配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。. pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩

49、沖液：照無菌檢查法（附錄 B )制備。取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫使溶解，濾清，分裝，滅菌。. pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液：按緩沖液（附錄 D）配制（取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得）后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。. 0.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉 9.0g，加水溶解使成 1000ml，過濾，分裝、滅菌。5.8. 培養(yǎng)基及其制備方法：培養(yǎng)基可按以下

50、處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。5.8.1. 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基及改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：照無菌檢查法（附錄 H）制備。5.8.1.1. 改良馬丁培養(yǎng)基配制：胨5.0g磷酸氫二鉀1.0g 酵母浸出粉2.0g硫酸鎂0.5g 葡萄糖20.0g水1000ml 除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，搖勻，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。5.8.1.2. 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基：按改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，加入14.0g瓊脂

51、，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.4±0.2，分裝，滅菌。5.8.2. 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。胨5.0g玫瑰紅鈉0.0133g 葡萄糖10.0g瓊脂14.0g 磷酸二氫鉀1.0g水1000ml 硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖、 玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。5.8.3. 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD）。胨10.0g瓊脂14.0g 酵母浸出粉5.0g水1000ml 葡萄糖20.0g 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，濾過，加入葡萄糖，分裝，滅菌。5.8.4. 膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）胨20.0g磷酸二氫鉀1.3g 乳糖5.0g牛膽鹽2.0g

52、氯化鈉5.0g（或去氧膽酸鈉）（0.5g） 磷酸氫二鉀4.0g水 1000ml除乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.4±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽或去氧膽酸鈉， 分裝，滅菌。5.8.5. 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基。胨 20.0g 0.04%溴甲酚紫水指示液25ml 乳糖10.0g水1000ml 牛膽鹽 5.0g除 0.04%溴甲酚紫水指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 值使 滅菌后為 7.4±0.2，加入 0.04%溴甲酚紫指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中。滅菌。所用倒管的規(guī)格應(yīng)保證產(chǎn)氣結(jié)果的觀察

53、。5.8.6. 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml20乳糖溶液5ml亞甲藍(lán)指示液1.31.6ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至 60，按無菌操作加入滅菌的其他3 種溶液，搖勻，傾注平皿。5.8.7. 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）。胨20.0g1%中性紅指示液3ml 乳糖10.0g瓊脂 14.0g 牛膽鹽 5.0g水1000ml 氯化鈉 5.0g除乳糖、1%中性指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為 7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約 60，傾注平皿。5.8.8.

54、 4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-D-glucuronide， MUG）培養(yǎng)基。 胨10.0g 磷酸二氫鉀（無水）0.9g 硫酸錳0.5mg 磷酸氫二鈉（無水）6.2g 硫酸鋅0.5mg 亞硫酸鈉 40mg 硫酸鎂 0.1g 去氧膽酸鈉 1.0g 氯化鈉 5.0g MUG 75mg 氯化鈣 50mg水 1000ml除 MUG 外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.3±0.1， 加入 MUG，溶解，每管分裝 5ml，滅菌。5.8.9. 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）。胨20.0g硫酸亞鐵 0.2g 牛肉浸出粉5.0g硫代硫酸鈉 0.

55、2g 乳糖10.0g0.2%酚磺酞指示液12.5ml 蔗糖10.0g瓊脂12.0g葡萄糖1.0g水1000ml氯化鈉5.0g除三種糖、0.2%酚磺酞指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為 7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌，制成高底層（23cm）短斜面。5.8.10. 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）。胨5.0g硫代硫酸鈉30.0g 牛膽鹽1.0g水1000ml 碳酸鈣10.0g取上述成分，混合，微溫溶解，滅菌。臨用前，取上述培養(yǎng)基，每 10ml 加入碘試液 0.2ml 和亮綠試液 0.1ml，混 勻。5.8.11. 沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）。 胨 5.0g 硫代硫酸鈉 8.5g 牛肉浸出粉5.0g中性紅指示液2.5ml 乳糖10.0g亮綠試液0.33ml 牛膽鹽8.5g瓊脂16.0g 枸櫞酸鈉8.5g水1000ml 枸櫞酸鐵銨1.0g除乳糖、中性紅指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié) pH 值使滅菌后為 7.2&#