中藥發(fā)酵的概況與關(guān)鍵技術(shù)

1、現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)研究現(xiàn)狀近年來，國際醫(yī)藥市場對傳統(tǒng)藥物及天然藥物的需求量正快速增長，以傳統(tǒng)藥及天然藥物資源開發(fā)創(chuàng)新藥物和相關(guān)健康產(chǎn)品已成為當今世界藥物研發(fā)的新趨勢、國際醫(yī)藥學術(shù)界的研究熱點和醫(yī)藥企業(yè)經(jīng)濟的快速增長點。我國作為中醫(yī)藥的發(fā)源地，擁有系統(tǒng)的中醫(yī)藥理論和極為豐富的天然藥物資源，雖然面臨著天然藥物市場強勁增長的有利形勢，但國際化步伐緩慢，其根本原因在于中藥現(xiàn)代化水平仍較低。中藥發(fā)酵技術(shù)是在繼承中藥炮制學發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取微生態(tài)學研究成果，結(jié)合現(xiàn)代微生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)，具有廣闊的發(fā)展空間。!古代中藥發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用歷史我國人民遠在多年前就學會利用發(fā)酵來釀酒，此后又相繼利用發(fā)

2、酵來生產(chǎn)醬、醋、豆豉和臭豆腐等食品。本草經(jīng)疏曰：“古人用曲，即造酒之曲，其氣味甘溫，性專消導，行脾胃滯氣，散臟腑風冷?！闭f明中藥臨床應(yīng)用之曲是在釀酒業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的，曲與酒相維系。后來人們在酒曲中加入其他藥物制成專供藥用的各類曲劑。本草綱目云：“古人用麴，多是造酒之麴。后醫(yī)乃造神麴，專以供藥，力更勝之?！笨梢姽湃嗽缫褜⑽⑸锇l(fā)酵應(yīng)用于中藥炮制。即將藥材與輔料拌和，一定溫度和濕度下通過微生物的發(fā)酵達到提高藥效、改變藥性、降低毒副作用等目的。直到現(xiàn)在，臨床仍在應(yīng)用的發(fā)酵$制品%中藥，如六神曲、淡豆豉、建曲、沉香曲、半夏曲、紅曲、豆黃等，均是利用炮制環(huán)境中的野生微生物$多為霉菌、酵母、細菌等%進

3、行多菌種固體發(fā)酵而成。發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用歷史悠久，也是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法之一，一般主要是起到中藥復合炮制的作用。不同的培養(yǎng)基經(jīng)同樣的發(fā)酵處理后會產(chǎn)生藥性的差異，可利用該特性生產(chǎn)不同適應(yīng)證的中藥。例如，發(fā)酵淡豆豉時，以桑葉、青蒿發(fā)酵者，藥性偏于寒涼，多用于風熱感冒或熱病胸中煩悶之癥；以麻黃、紫蘇發(fā)酵者，藥性偏于辛溫，多用于風寒感冒頭痛之癥。在清代，根據(jù)輔料中藥及治療功能的不同，又制出了皂角曲、竹瀝曲、麻油曲、牛膽曲、開郁曲、海粉曲、覆天曲等!#種藥曲。"!" #利用中藥培養(yǎng)基發(fā)酵藥用真菌菌物界估計逾十萬種，可供藥用的高等真菌約&#余種，利用潛力巨大。國內(nèi)&#

4、世紀#年代興起深層培養(yǎng)$或發(fā)酵%，&#世紀(#年代中國醫(yī)學科學院藥物研究所進行的冬蟲夏草大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)研究，也僅是對菌類自身發(fā)酵的研究，如靈芝、冬蟲夏草、香菇發(fā)酵等，且大多是單一發(fā)酵。目前對靈芝、云芝、冬蟲夏草、灰樹花、密環(huán)菌、金針菇、香菇、姬松茸、茯苓等很多菌種的發(fā)酵技術(shù)已日趨成熟) ! * !# +。莊毅曾提出了菌質(zhì)的概念) ! * !& +，即用一定的藥用菌菌種接種在一定的固體基質(zhì)上，在一定環(huán)境條件下，經(jīng)過一定時間發(fā)酵$發(fā)酵周期%，在特定的質(zhì)量指標控制下達到發(fā)酵終點而產(chǎn)生菌質(zhì)?？刹捎矛F(xiàn)代技術(shù)將有效真菌與中草藥組成的不同發(fā)酵基質(zhì)構(gòu)成各種發(fā)酵組合，在一定條件下進行發(fā)酵，產(chǎn)生各

5、種性質(zhì)不同的菌質(zhì)?？梢岳弥兴幾鳛榕囵B(yǎng)基的組成部分，構(gòu)建藥性菌質(zhì)，比較發(fā)酵前后中藥相關(guān)成分的變化，為中藥與藥用真菌的結(jié)合尋找突破點，并開發(fā)具有良好功效的藥物。王玉紅等) !, +在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的黃芪以促進靈芝的生長和靈芝多糖的產(chǎn)生，結(jié)果其多糖的組分發(fā)生了變化，有可能產(chǎn)生了新的物質(zhì)。尤建良等) !" +將中藥抗癌復方“康復靈”$ 主要含黨參、麥冬、薏苡仁、豬苓、淮山藥等 % 以靈芝菌進行生物發(fā)酵，結(jié)果表明靈芝-中藥制劑發(fā)酵液的抑瘤率達",. (/0，比單獨的靈芝發(fā)酵液、單味中藥制劑和靈芝發(fā)酵液-中藥制劑混合液均有明顯提高。!" !利用微生物轉(zhuǎn)化中藥活性成分微

6、生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是利用微生物生長代謝過程中產(chǎn)生的酶對特定底物進行結(jié)構(gòu)修飾的化學反應(yīng)，利用微生物發(fā)酵炮制中藥的過程實際上就是一種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，中藥成分的生物轉(zhuǎn)化是研究開發(fā)新藥的重要方面。微生物在生長過程中可以分泌幾十種胞外酶于培養(yǎng)基中，其生命活動所產(chǎn)生的胞內(nèi)酶更是成百上千，這些豐富而強大的酶系就可能成為中藥發(fā)生化學反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于微生物具有種類繁多、繁殖快等特點，所以微生物轉(zhuǎn)化常被用來對天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行修飾，以獲得一些結(jié)構(gòu)更合理或活性更好的先導化合物。!）提高藥物療效：通過微生物與中藥共發(fā)酵來進行中藥炮制，微生物發(fā)酵的次生代謝物與藥物成分發(fā)生協(xié)同作用可增強藥效，從而獲得藥效更強的藥物。王貞佐

7、等) !1 +在培養(yǎng)基中加入中藥$焦三仙、黃芪、當歸、海馬、柴胡%提取液，探索其對冬蟲夏草生長及菌絲體中有效成分含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對冬蟲夏草菌絲體生長有藥學專論!國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學技術(shù)研究專項，項目編號：# * #/23""。中藥發(fā)酵的概況與關(guān)鍵技術(shù)!傅超美，冷 靜（成都中醫(yī)藥大學，四川 成都!#/1）摘要：中藥發(fā)酵技術(shù)是在繼承中藥炮制學發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取微生態(tài)學研究成果，結(jié)合現(xiàn)代微生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)。發(fā)酵中藥是目前中藥研究的熱點，該文對近!#年中藥發(fā)酵的概況進行綜述，并對其關(guān)鍵技術(shù)進行了探討。關(guān)鍵詞：中藥；發(fā)酵；微生物；關(guān)鍵技術(shù)中圖分類號：

8、#"$"% &!文獻標識碼：文章編號：!() * +,-! ."($ /!0 * (! * (-1232456 789:598;3 53< =2> ?2A3;6;B82C 83 D24E239598;3 ;F GA832C2 H2<88356!" #$%&()，*(+, -)+,. #$(+,/" 0+)1(23)45 &6 72%/)4)&+%8 #$)+(3( 9(/):)+(; #$(+,/" <):$"%+; #$)+% =>?A B!"#$%&

9、amp;$：45 678 9:;< =>?8;<5A ?B 78>9:C D8E<<5:C;F 678 B8>D856:6<?5 6875?C?AG ?B H7<58;8 D8E<<5:C I7<7 :9;?>98E 678 >8;8:>7 >8;JC6;<5 D<>?8?C?AG :5E ?D9<58E I<67 D?E8>5 B8>D856:6<?5 85A<588><5A < : 58I 7<A7 * 687 =7:

10、>D:8J6<:C 6875?C?AG. K8856CG B8>D8568E ?BH7<58;8 D8E<<5:C 7:; 98?D8 7?6;=?6 <5 67< >8;8:>7 B<8CE. L7< :>6<C8 A<M8; : ;JDD:>G ?5 678 A858>:C ;<6J:6<?5 ?B H7<58;8 D8E<<5:CB8>D856:6<?5 <5 58:>CG : E8:E8 :5E E<J; ?5 <6;

11、N8G 6875?C?A<8;.()* +,%-#：H7<58;8 D8E<<5:C；B8>D856:6<?5；D<>?98；N8G 6875?C?A<8;中國藥業(yè)!"#$% &"%(%)*+,#)%-.·!·!""#年第$%卷第$&期明顯的刺激作用，且能顯著提高蟲草菌絲體中主要有效成分甘露醇的含量，對發(fā)酵液中多糖含量也有影響。任莉穎等" #$ %發(fā)現(xiàn)，經(jīng)夏枯草芽孢桿菌&! #(發(fā)酵炮制的紅花，抗氧化功效顯著提高，可能是其中的一些有效成分經(jīng)&

12、;! #(生物轉(zhuǎn)化所致。!）產(chǎn)生新的藥效物質(zhì)和藥理作用：微生物在代謝過程中分泌的胞外酶可將藥物成分分解轉(zhuǎn)化，形成新的化合物，某些中藥的有效成分經(jīng)發(fā)酵后可以產(chǎn)生新的藥效更強的物質(zhì)。李國紅等" #) %用枯草芽孢桿菌對三七須根進行發(fā)酵，并對三七中的皂苷成分進行分離，得到了*個化合物，其中人參皂苷+,-在三七及三七原料藥中均未被檢測到，說明該化合物是通過發(fā)酵產(chǎn)生的。又如采用含有根霉菌和! 賴氨酸等物質(zhì)的酵曲發(fā)酵進行五倍子發(fā)酵" #. %，發(fā)酵后可產(chǎn)生沒食子酸，并產(chǎn)生了抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗過敏及利膽和擴張支氣管等新的藥理作用，而未發(fā)酵的五倍子卻沒有這些作用。(）轉(zhuǎn)化有效

13、成分：進入人體后不能直接被利用的藥物有效活性組分，可利用發(fā)酵技術(shù)在體外完成轉(zhuǎn)化而使之能被機體直接利用，迅速發(fā)揮應(yīng)有效能。!/世紀0/年代初，小橋恭一" #0 %發(fā)現(xiàn)中草藥成分番瀉葉苷、蘆薈苷可借助腸道細菌轉(zhuǎn)化為致瀉有效成分番瀉苷元和蘆薈大黃素，從而起到治療作用。又有報道，在中藥有效成分與細菌的生物轉(zhuǎn)化過程中，許多苷類、黃酮類、黃酮醇、黃烷酮類、香豆素類等均經(jīng)過腸道菌進行了化學修飾。田天麗等" !/ %利用能產(chǎn)生! 葡萄糖苷酶的一株根霉菌種與虎杖共發(fā)酵，將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，同時將結(jié)合蒽醌苷轉(zhuǎn)化為大黃素。薛慧玲等" !# %采用篩選獲得的! 葡萄糖醛酸酶產(chǎn)生菌12

14、 #/對黃芩中的主要前體物質(zhì)黃芩苷進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物確定為有效成分黃芩素（黃芩苷元），得率為(3 !$4，是原藥材含量的*3 (倍。!中藥發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢中藥發(fā)酵是現(xiàn)代中藥研究的熱點，其優(yōu)點可概括為5 #）保護中藥活性成分免遭破壞，使藥物的有效組分、活性物質(zhì)最大限度地得以提取、利用；!）提高中藥藥性，降低藥物的毒副作用；(）所優(yōu)選的人體有益菌種本身能補充或增強原有藥物的功能；-）產(chǎn)生新的活性物質(zhì)；*）為中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾提供新途徑；$）節(jié)省藥材資源，保護環(huán)境；)）是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、具有高科技水平的又一新技術(shù)，生產(chǎn)工藝可控，所得產(chǎn)物精確，制劑方便，便于與國際接軌。"中藥發(fā)酵技術(shù)中的關(guān)鍵

15、技術(shù)目前中藥發(fā)酵技術(shù)無論在基礎(chǔ)理論方面還是在方法上的研究仍處于起步階段，對單味藥材發(fā)酵和傳統(tǒng)復方發(fā)酵開發(fā)得都很少，故少有投入生產(chǎn)的發(fā)酵新藥。同時中藥發(fā)酵技術(shù)也面臨一些問題，如中醫(yī)藥自身體系的模糊性、中藥成分的復雜性、中藥發(fā)酵機理的不明確性、微生物生長特性的多樣性以及在中藥發(fā)酵過程中如何貫徹中醫(yī)理論的指導等。因此，對中藥發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的正確把握關(guān)系到其發(fā)展方向和前景，筆者認為，今后以下幾方面的工作有待深入研究。#）中藥發(fā)酵機理：目前微生物發(fā)酵中藥的機理已有一些基礎(chǔ)和推斷，但由于中藥化學成分的復雜性和作用機理的不明確性，中藥的有效成分、一些非有效成分及特殊的基質(zhì)環(huán)境與微生物的相互 作 用 尚 有 待

16、 研究；針對具體的中藥及復方，明確其發(fā)酵作用機理，揭示發(fā)酵中藥的科學內(nèi)涵，其發(fā)酵體系的特點和作用機理仍待進一步研究。!）中藥發(fā)酵共性技術(shù)：加強對單味中藥、中藥提取物、中藥復方發(fā)酵技術(shù)、微生物培養(yǎng)的系統(tǒng)研究，并進行成分的分離、鑒定和相關(guān)藥理試驗，明確微生物的性質(zhì)以及變化過程，建立起統(tǒng)一的能應(yīng)用于大多數(shù)中藥發(fā)酵的通用方法與共性技術(shù)體系，為實現(xiàn)發(fā)酵中藥的現(xiàn)代化、科學化、國際化提供新的途徑和方法。(）優(yōu)良菌種選育技術(shù)：菌種的選育是中藥發(fā)酵的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。因此，應(yīng)該加大發(fā)酵菌種的選育和評價工作，使更多優(yōu)良的菌種能夠最大限度作用于中藥，從而為更多有價值的發(fā)酵中藥產(chǎn)品的研制奠定基礎(chǔ)。-）現(xiàn)代復合微生物發(fā)酵技術(shù)

17、：多菌種發(fā)酵較單一菌種發(fā)酵具有更強的生物轉(zhuǎn)化能力，但也是發(fā)酵研究的難點。傳統(tǒng)中藥發(fā)酵多是自然界混合菌種天然發(fā)酵的結(jié)果，因那時人們并不知道微生物和發(fā)酵的關(guān)系，從而很難人為控制發(fā)酵過程。如何應(yīng)用現(xiàn)代微生物工程的相關(guān)技術(shù)，進行中藥多菌種發(fā)酵，提高發(fā)酵生產(chǎn)的可控性、穩(wěn)定性，提高發(fā)酵中藥的有效性和安全性，是進行現(xiàn)代發(fā)酵中藥研究的又一關(guān)鍵技術(shù)。*）發(fā)酵中藥篩選模型和多維評價體系：中藥具有品種多樣性、化學成分復雜性、藥效作用多向性的特點，中藥復方具有整體性、系統(tǒng)性、復雜性、非加和性等特點。因此，中藥及其復方在發(fā)酵過程中如何遵循中醫(yī)藥理論的指導，進行發(fā)酵后選用何種評價指標和評價模型，建立發(fā)酵中藥篩選模型和多維

18、評價體系，是發(fā)酵中藥研究的又一技術(shù)難點。#結(jié)語中藥現(xiàn)代化研究已是一個醫(yī)藥、生物等眾多學科關(guān)心的課題。發(fā)酵中藥是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的完美結(jié)合，在中藥新藥研究開發(fā)中占有越來越重要的位置。發(fā)酵中藥也必將在中藥現(xiàn)代化進程中表現(xiàn)出強大的生命力，為提高我國中藥行業(yè)的國際競爭力，使中藥走向世界，造福人類做出新的貢獻。作者簡介：傅超美（#0$! ），男，教授，博士生導師，主要從事中藥新制劑、新工藝與新劑型的研究，6 電子信箱 78,9:;<=>? #!$3 8:;；冷靜（#0)0 ），女，博士研究生，研究方向為中藥新制劑與新劑型，本文通訊作者，6 電話 7/!. $#./#$*$ 6電子信箱

19、7ABA<CDB=CD E=C93 8:;。參考文獻：" # %劉少琴，趙紫華，馬彩霞，等3藥用真菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的研究進展"F % 3中國現(xiàn)代中藥，!/$，. 6 ) 7 5 !. (#，(*3" ! %孫東平，潘 鋒，史小麗，等3靈芝菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及靈芝胞外多糖的分離純化"F % 3中草藥，!/，(# 6 #! 7：0-#3" ( %鄧百萬，陳文強3云芝液體培養(yǎng)及富集硒研究 "F % 3氨基酸和生物資源，!/，! 6 - 7：!# !-3" - %李少萍，季 萍3天然發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中核苷類成分的含量及其變化&q

20、uot;F % 3藥學學報，!/#，($ 6 $ 7：-($3" * %裘娟萍，孫培龍3灰樹花深層發(fā)酵工藝的研究 "F % 3微生物學通報，!/#，!. 6 ( 7：( (*3" $ %譚周進，謝達平，王 征，等3蜜環(huán)菌胞外多糖的發(fā)酵條件研究"F % 3微生物學通報，!/!，!0 6 ( 7：( ()3" ) %胡斌杰，王方林，趙 平3金針菇深層培養(yǎng)獲得多糖的最佳發(fā)酵條件研究"F % 3安徽農(nóng)業(yè)科學，!/)，(* 6 #/ 7 5 ! .-! ! .-(，! .*)3" . %林翔鷹，黨俊梅，馬凱峰，等3香菇液體菌種深層發(fā)酵

21、的研究"F % 3食用菌，!/$，!. 6 # 7 5 #- #$3" 0 %陳 敏，蔣予箭，嚴燕姣，等3姬松茸液體發(fā)酵條件的研究"F % 3浙江工商大學學報，!/$，(5 *) $/3藥學專論中國藥業(yè)!"#$% &"%(%)*+,#)%-.·!·!""#年第$%卷第$&期" #$ %李 羿，萬德光，裴 瑾&茯苓液體發(fā)酵條件的研究" % &成都中醫(yī)藥大學學報，($)，(* + # ,：)( - )&" # %莊 毅&菌質(zhì) 中藥的

22、一個新領(lǐng)域"% &中藥新藥與臨床藥理，#.(，* + ( , / 0.&" #( %莊 毅&應(yīng)用藥用真菌新型固體發(fā)酵工程技術(shù)研制中藥一類新藥的建議" % &中藥新藥與臨床藥理，#.)，1 + 0 , / 0#&" #! %王玉紅，丁重陽，徐 鵬，等&中藥黃芪對發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖的影響" % &食品與生物技術(shù)學報，($)，(0（(）：!*&" #0 %尤建良，趙景芳，章克昌，等&發(fā)酵型中藥生物制劑“康復靈”抑瘤實驗研究" % &實用臨床醫(yī)藥雜志，($

23、)，. + * ,：01 - 02&" #) %王貞佐，呼海濤3張 銳，等&中藥對冬蟲夏草發(fā)酵的影響" % &食品科技，($1，!# + ( , / *&" #1 %任莉穎，劉 康，李宏婧&發(fā)酵炮制對紅花抗氧化活性的影響" % &中華臨床醫(yī)學雜志，($)，1（*）/ 02&" #2 %李國紅，沈月毛，王啟方3等&發(fā)酵三七中的皂苷成分研究" % &中草藥，($)，!1（0）/ 0.&" #* %王和英&五倍子的發(fā)酵炮制" % &a

24、mp;基層中藥雜志，($，#0（0）/ 0$&" #. %小橋恭一&中藥有效成分與腸道細菌的關(guān)系" % &醫(yī)學與哲學，#.)，#1（#）：).*&" ($ %田天麗，王 嬙，王永宏3等&虎杖的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化及其發(fā)酵產(chǎn)物提取分離的研究" % &天然產(chǎn)物分離，($1，0 + 0 ,：# - 0&" (# %薛慧玲，徐萌萌，陽 泰3等&黃芩微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取" % &天然產(chǎn)物分離3 ($)，! + ) ,：) - 2，#&!收稿日期："#$ %

25、#& % # (蛇毒是一種具有不同生物活性的蛋白質(zhì)和肽類的復雜混合物3相對分子質(zhì)量在1 4 #$!5 #$ 4 #$!之間。蛇毒蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)特點可歸為以下幾個蛋白質(zhì)超家族：絲氨酸蛋白酶家族、金屬蛋白酶家族、磷脂酶6(（786(）家族、凝集素家族、富含半胱氨酸蛋白質(zhì)家族和三指毒素家族。其中很多成分已用于疾病的診斷和治療，如! -銀環(huán)蛇毒素可用于診斷重癥肌無力及治療頑固性神經(jīng)痛、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和復發(fā)性皰疹性角膜損傷等" # %，蛇毒類凝血酶可有效治療血栓栓塞性疾病等" ( %。蛇毒蛋白的主要來源是捕蛇取毒后進一步分離純化，這樣獲得的蛇毒蛋白成本高、周期長、質(zhì)量難以控

26、制，長期下去還會耗竭生物資源，破壞生態(tài)平衡。而且同種蛇毒的產(chǎn)地不同，其成分和作用就有可能不同，從而影響療效的評價。生物工程技術(shù)的縱深發(fā)展使蛇毒蛋白的規(guī)?；a(chǎn)成為可能，而且可以根據(jù)不同的目的對天然蛇毒蛋白基因進行改造。早在#.)年，美國、法國和英國的科學家聯(lián)合克隆并表達非洲綠眼鏡蛇毒素基因，獲得了幾種具有與天然蛇神經(jīng)毒素同樣毒性的神經(jīng)毒素" ! %。隨后陸續(xù)不斷有用生物工程方法生產(chǎn)蛇毒蛋白的報道。盡管蛇毒蛋白基因工程表達系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴大到酵母、昆蟲及哺乳動物細胞3但大腸桿菌仍是應(yīng)用最廣泛的蛇毒蛋白基因表達工具。現(xiàn)將蛇毒蛋白基因的大腸桿菌表達策略作一介紹。&蛇毒蛋白目的基

27、因的獲取方法!" !從#$%&文庫中獲得蛇毒9:;6文庫包含了毒腺中全部的<=;6序列。根據(jù)目的蛋白的部分氨基酸或核苷酸序列設(shè)計寡核苷酸或核酸探針3利用核酸分子雜交+>?ABCD EF?A ,從9:;6文庫中篩選出含目的基因的克隆3然后利用聚合酶鏈反應(yīng)（7G=）方法擴增出目的基因。!" 利用反轉(zhuǎn)錄(聚合酶鏈反應(yīng)（)* ( +,)）技術(shù)獲得將蛇毒腺細胞破碎提取總<=;63以總<=;6為模板反轉(zhuǎn)錄為9:;63利用7G=方法3以9:;6為模板擴增出目的基因。毒蛇的種類繁多，蛇毒蛋白成分及含量隨蛇種而異，即使是同一種蛇，受地區(qū)分布和周圍環(huán)境的影響，蛇

28、毒蛋白成分的<=;6在毒腺細胞總<=;6中的比例或豐度也會存在差異。從9:;6文庫中擴增和利用=H - 7G=技術(shù)獲得目的基因均受<=;6豐度的影響。目的蛋白的<=;6在毒腺細胞中的拷貝越多，擴增出的目的基因就會越多，而低豐度的<=;6會增加擴增的難度。從中華眼鏡蛇毒腺9:;6表達文庫中成功擴增了細胞毒素（GHI - !）和786(基因的9:;6，證實了GHI - !和786(<=;6在中華眼鏡蛇毒腺中豐度較高，GHI - !和786(在中華眼鏡蛇粗毒中含量豐富" 0 %。!" -人工合成在已知天然蛇毒蛋白全序列的情況下3根據(jù)大腸桿菌簡并

29、密碼子的嗜好性可人工合成目的基因。對于小片段+小于0$ EJ ,的基因，采取互補鏈全部合成，先對合成的寡核苷酸片段進行磷酸化，通過混合、退火實現(xiàn)正確匹配，再經(jīng)連接酶連接相鄰片段的!K和)K端而完成拼接過程。但基因序列長度在2$ EJ以上時，全基因合成不僅成本高，而且不容易控制好數(shù)目增多的寡核苷酸鏈的正確退藥學專論蛇毒蛋白基因的大腸桿菌表達研究進展!孟文麗，許云祿+ 福建醫(yī)科大學蛇毒研究所，福建 福州!)$0 ,摘要：蛇毒是多種生物活性蛋白和多肽的混合物3由于蛇毒在基礎(chǔ)醫(yī)學和臨床上的特殊作用以及天然蛇毒蛋白獲取方法的局限性3采用生物工程方法規(guī)?；a(chǎn)高純度的蛇毒蛋白已成為當前及今后的研究方向。該

30、文就蛇毒蛋白基因在大腸桿菌中表達的研究近況進行介紹。關(guān)鍵詞：蛇毒蛋白；大腸桿菌；基因表達中圖分類號：)*+, -；.+$-文獻標識碼：/文章編號：&#- % 0*1& !"#$ (& % #1 % #1)2324567 /894:62 ;< =:4>2 ?2:; A5;B2C: D2:2 EFG5233C;: C: /0 )1-#!"#$ %"#&( )* +*#&*, -"."/012 3#.44*4" 56 7#/8" 9"#5:( ;*</# !"=1/& >#?"