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文檔簡(jiǎn)介
1、現(xiàn)代中藥發(fā)酵技術(shù)研究現(xiàn)狀近年來(lái),國(guó)際醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)傳統(tǒng)藥物及天然藥物的需求量正快速增長(zhǎng),以傳統(tǒng)藥及天然藥物資源開(kāi)發(fā)創(chuàng)新藥物和相關(guān)健康產(chǎn)品已成為當(dāng)今世界藥物研發(fā)的新趨勢(shì)、國(guó)際醫(yī)藥學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)和醫(yī)藥企業(yè)經(jīng)濟(jì)的快速增長(zhǎng)點(diǎn)。我國(guó)作為中醫(yī)藥的發(fā)源地,擁有系統(tǒng)的中醫(yī)藥理論和極為豐富的天然藥物資源,雖然面臨著天然藥物市場(chǎng)強(qiáng)勁增長(zhǎng)的有利形勢(shì),但國(guó)際化步伐緩慢,其根本原因在于中藥現(xiàn)代化水平仍較低。中藥發(fā)酵技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上,吸取微生態(tài)學(xué)研究成果,結(jié)合現(xiàn)代微生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù),具有廣闊的發(fā)展空間。!古代中藥發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用歷史我國(guó)人民遠(yuǎn)在多年前就學(xué)會(huì)利用發(fā)酵來(lái)釀酒,此后又相繼利用發(fā)
2、酵來(lái)生產(chǎn)醬、醋、豆豉和臭豆腐等食品。本草經(jīng)疏曰:“古人用曲,即造酒之曲,其氣味甘溫,性專(zhuān)消導(dǎo),行脾胃滯氣,散臟腑風(fēng)冷。”說(shuō)明中藥臨床應(yīng)用之曲是在釀酒業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的,曲與酒相維系。后來(lái)人們?cè)诰魄屑尤肫渌幬镏瞥蓪?zhuān)供藥用的各類(lèi)曲劑。本草綱目云:“古人用麴,多是造酒之麴。后醫(yī)乃造神麴,專(zhuān)以供藥,力更勝之?!笨梢?jiàn)古人早已將微生物發(fā)酵應(yīng)用于中藥炮制。即將藥材與輔料拌和,一定溫度和濕度下通過(guò)微生物的發(fā)酵達(dá)到提高藥效、改變藥性、降低毒副作用等目的。直到現(xiàn)在,臨床仍在應(yīng)用的發(fā)酵$制品%中藥,如六神曲、淡豆豉、建曲、沉香曲、半夏曲、紅曲、豆黃等,均是利用炮制環(huán)境中的野生微生物$多為霉菌、酵母、細(xì)菌等%進(jìn)
3、行多菌種固體發(fā)酵而成。發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用歷史悠久,也是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法之一,一般主要是起到中藥復(fù)合炮制的作用。不同的培養(yǎng)基經(jīng)同樣的發(fā)酵處理后會(huì)產(chǎn)生藥性的差異,可利用該特性生產(chǎn)不同適應(yīng)證的中藥。例如,發(fā)酵淡豆豉時(shí),以桑葉、青蒿發(fā)酵者,藥性偏于寒涼,多用于風(fēng)熱感冒或熱病胸中煩悶之癥;以麻黃、紫蘇發(fā)酵者,藥性偏于辛溫,多用于風(fēng)寒感冒頭痛之癥。在清代,根據(jù)輔料中藥及治療功能的不同,又制出了皂角曲、竹瀝曲、麻油曲、牛膽曲、開(kāi)郁曲、海粉曲、覆天曲等!#種藥曲。"!" #利用中藥培養(yǎng)基發(fā)酵藥用真菌菌物界估計(jì)逾十萬(wàn)種,可供藥用的高等真菌約&#余種,利用潛力巨大。國(guó)內(nèi)&#
4、世紀(jì)#年代興起深層培養(yǎng)$或發(fā)酵%,&#世紀(jì)(#年代中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所進(jìn)行的冬蟲(chóng)夏草大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)研究,也僅是對(duì)菌類(lèi)自身發(fā)酵的研究,如靈芝、冬蟲(chóng)夏草、香菇發(fā)酵等,且大多是單一發(fā)酵。目前對(duì)靈芝、云芝、冬蟲(chóng)夏草、灰樹(shù)花、密環(huán)菌、金針菇、香菇、姬松茸、茯苓等很多菌種的發(fā)酵技術(shù)已日趨成熟) ! * !# +。莊毅曾提出了菌質(zhì)的概念) ! * !& +,即用一定的藥用菌菌種接種在一定的固體基質(zhì)上,在一定環(huán)境條件下,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間發(fā)酵$發(fā)酵周期%,在特定的質(zhì)量指標(biāo)控制下達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)而產(chǎn)生菌質(zhì)??刹捎矛F(xiàn)代技術(shù)將有效真菌與中草藥組成的不同發(fā)酵基質(zhì)構(gòu)成各種發(fā)酵組合,在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)生各
5、種性質(zhì)不同的菌質(zhì)。可以利用中藥作為培養(yǎng)基的組成部分,構(gòu)建藥性菌質(zhì),比較發(fā)酵前后中藥相關(guān)成分的變化,為中藥與藥用真菌的結(jié)合尋找突破點(diǎn),并開(kāi)發(fā)具有良好功效的藥物。王玉紅等) !, +在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的黃芪以促進(jìn)靈芝的生長(zhǎng)和靈芝多糖的產(chǎn)生,結(jié)果其多糖的組分發(fā)生了變化,有可能產(chǎn)生了新的物質(zhì)。尤建良等) !" +將中藥抗癌復(fù)方“康復(fù)靈”$ 主要含黨參、麥冬、薏苡仁、豬苓、淮山藥等 % 以靈芝菌進(jìn)行生物發(fā)酵,結(jié)果表明靈芝-中藥制劑發(fā)酵液的抑瘤率達(dá)",. (/0,比單獨(dú)的靈芝發(fā)酵液、單味中藥制劑和靈芝發(fā)酵液-中藥制劑混合液均有明顯提高。!" !利用微生物轉(zhuǎn)化中藥活性成分微
6、生物轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是利用微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶對(duì)特定底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的化學(xué)反應(yīng),利用微生物發(fā)酵炮制中藥的過(guò)程實(shí)際上就是一種生物轉(zhuǎn)化反應(yīng),中藥成分的生物轉(zhuǎn)化是研究開(kāi)發(fā)新藥的重要方面。微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中可以分泌幾十種胞外酶于培養(yǎng)基中,其生命活動(dòng)所產(chǎn)生的胞內(nèi)酶更是成百上千,這些豐富而強(qiáng)大的酶系就可能成為中藥發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。由于微生物具有種類(lèi)繁多、繁殖快等特點(diǎn),所以微生物轉(zhuǎn)化常被用來(lái)對(duì)天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,以獲得一些結(jié)構(gòu)更合理或活性更好的先導(dǎo)化合物。!)提高藥物療效:通過(guò)微生物與中藥共發(fā)酵來(lái)進(jìn)行中藥炮制,微生物發(fā)酵的次生代謝物與藥物成分發(fā)生協(xié)同作用可增強(qiáng)藥效,從而獲得藥效更強(qiáng)的藥物。王貞佐
7、等) !1 +在培養(yǎng)基中加入中藥$焦三仙、黃芪、當(dāng)歸、海馬、柴胡%提取液,探索其對(duì)冬蟲(chóng)夏草生長(zhǎng)及菌絲體中有效成分含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌絲體生長(zhǎng)有藥學(xué)專(zhuān)論!國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專(zhuān)項(xiàng),項(xiàng)目編號(hào):# * #/23""。中藥發(fā)酵的概況與關(guān)鍵技術(shù)!傅超美,冷 靜(成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都!#/1)摘要:中藥發(fā)酵技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上,吸取微生態(tài)學(xué)研究成果,結(jié)合現(xiàn)代微生物工程而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)。發(fā)酵中藥是目前中藥研究的熱點(diǎn),該文對(duì)近!#年中藥發(fā)酵的概況進(jìn)行綜述,并對(duì)其關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了探討。關(guān)鍵詞:中藥;發(fā)酵;微生物;關(guān)鍵技術(shù)中圖分類(lèi)號(hào):
8、#"$"% &!文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:文章編號(hào):!() * +,-! ."($ /!0 * (! * (-1232456 789:598;3 53< =2> ?2A3;6;B82C 83 D24E239598;3 ;F GA832C2 H2<88356!" #$%&(),*(+, -)+,. #$(+,/" 0+)1(23)45 &6 72%/)4)&+%8 #$)+(3( 9(/):)+(; #$(+,/" <):$"%+; #$)+% =>?A B!"#$%&
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11、N8G 6875?C?A<8;.()* +,%-#:H7<58;8 D8E<<5:C;B8>D856:6<?5;D<>?98;N8G 6875?C?A<8;中國(guó)藥業(yè)!"#$% &"%(%)*+,#)%-.·!·!""#年第$%卷第$&期明顯的刺激作用,且能顯著提高蟲(chóng)草菌絲體中主要有效成分甘露醇的含量,對(duì)發(fā)酵液中多糖含量也有影響。任莉穎等" #$ %發(fā)現(xiàn),經(jīng)夏枯草芽孢桿菌&! #(發(fā)酵炮制的紅花,抗氧化功效顯著提高,可能是其中的一些有效成分經(jīng)&
12、;! #(生物轉(zhuǎn)化所致。!)產(chǎn)生新的藥效物質(zhì)和藥理作用:微生物在代謝過(guò)程中分泌的胞外酶可將藥物成分分解轉(zhuǎn)化,形成新的化合物,某些中藥的有效成分經(jīng)發(fā)酵后可以產(chǎn)生新的藥效更強(qiáng)的物質(zhì)。李國(guó)紅等" #) %用枯草芽孢桿菌對(duì)三七須根進(jìn)行發(fā)酵,并對(duì)三七中的皂苷成分進(jìn)行分離,得到了*個(gè)化合物,其中人參皂苷+,-在三七及三七原料藥中均未被檢測(cè)到,說(shuō)明該化合物是通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的。又如采用含有根霉菌和! 賴(lài)氨酸等物質(zhì)的酵曲發(fā)酵進(jìn)行五倍子發(fā)酵" #. %,發(fā)酵后可產(chǎn)生沒(méi)食子酸,并產(chǎn)生了抗菌、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤、抗過(guò)敏及利膽和擴(kuò)張支氣管等新的藥理作用,而未發(fā)酵的五倍子卻沒(méi)有這些作用。()轉(zhuǎn)化有效
13、成分:進(jìn)入人體后不能直接被利用的藥物有效活性組分,可利用發(fā)酵技術(shù)在體外完成轉(zhuǎn)化而使之能被機(jī)體直接利用,迅速發(fā)揮應(yīng)有效能。!/世紀(jì)0/年代初,小橋恭一" #0 %發(fā)現(xiàn)中草藥成分番瀉葉苷、蘆薈苷可借助腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化為致瀉有效成分番瀉苷元和蘆薈大黃素,從而起到治療作用。又有報(bào)道,在中藥有效成分與細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中,許多苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、黃酮醇、黃烷酮類(lèi)、香豆素類(lèi)等均經(jīng)過(guò)腸道菌進(jìn)行了化學(xué)修飾。田天麗等" !/ %利用能產(chǎn)生! 葡萄糖苷酶的一株根霉菌種與虎杖共發(fā)酵,將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,同時(shí)將結(jié)合蒽醌苷轉(zhuǎn)化為大黃素。薛慧玲等" !# %采用篩選獲得的! 葡萄糖醛酸酶產(chǎn)生菌12
14、 #/對(duì)黃芩中的主要前體物質(zhì)黃芩苷進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,產(chǎn)物確定為有效成分黃芩素(黃芩苷元),得率為(3 !$4,是原藥材含量的*3 (倍。!中藥發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢(shì)中藥發(fā)酵是現(xiàn)代中藥研究的熱點(diǎn),其優(yōu)點(diǎn)可概括為5 #)保護(hù)中藥活性成分免遭破壞,使藥物的有效組分、活性物質(zhì)最大限度地得以提取、利用;!)提高中藥藥性,降低藥物的毒副作用;()所優(yōu)選的人體有益菌種本身能補(bǔ)充或增強(qiáng)原有藥物的功能;-)產(chǎn)生新的活性物質(zhì);*)為中藥活性成分結(jié)構(gòu)修飾提供新途徑;$)節(jié)省藥材資源,保護(hù)環(huán)境;))是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、具有高科技水平的又一新技術(shù),生產(chǎn)工藝可控,所得產(chǎn)物精確,制劑方便,便于與國(guó)際接軌。"中藥發(fā)酵技術(shù)中的關(guān)鍵
15、技術(shù)目前中藥發(fā)酵技術(shù)無(wú)論在基礎(chǔ)理論方面還是在方法上的研究仍處于起步階段,對(duì)單味藥材發(fā)酵和傳統(tǒng)復(fù)方發(fā)酵開(kāi)發(fā)得都很少,故少有投入生產(chǎn)的發(fā)酵新藥。同時(shí)中藥發(fā)酵技術(shù)也面臨一些問(wèn)題,如中醫(yī)藥自身體系的模糊性、中藥成分的復(fù)雜性、中藥發(fā)酵機(jī)理的不明確性、微生物生長(zhǎng)特性的多樣性以及在中藥發(fā)酵過(guò)程中如何貫徹中醫(yī)理論的指導(dǎo)等。因此,對(duì)中藥發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的正確把握關(guān)系到其發(fā)展方向和前景,筆者認(rèn)為,今后以下幾方面的工作有待深入研究。#)中藥發(fā)酵機(jī)理:目前微生物發(fā)酵中藥的機(jī)理已有一些基礎(chǔ)和推斷,但由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性和作用機(jī)理的不明確性,中藥的有效成分、一些非有效成分及特殊的基質(zhì)環(huán)境與微生物的相互 作 用 尚 有 待
16、 研究;針對(duì)具體的中藥及復(fù)方,明確其發(fā)酵作用機(jī)理,揭示發(fā)酵中藥的科學(xué)內(nèi)涵,其發(fā)酵體系的特點(diǎn)和作用機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。!)中藥發(fā)酵共性技術(shù):加強(qiáng)對(duì)單味中藥、中藥提取物、中藥復(fù)方發(fā)酵技術(shù)、微生物培養(yǎng)的系統(tǒng)研究,并進(jìn)行成分的分離、鑒定和相關(guān)藥理試驗(yàn),明確微生物的性質(zhì)以及變化過(guò)程,建立起統(tǒng)一的能應(yīng)用于大多數(shù)中藥發(fā)酵的通用方法與共性技術(shù)體系,為實(shí)現(xiàn)發(fā)酵中藥的現(xiàn)代化、科學(xué)化、國(guó)際化提供新的途徑和方法。()優(yōu)良菌種選育技術(shù):菌種的選育是中藥發(fā)酵的關(guān)鍵和基礎(chǔ)。因此,應(yīng)該加大發(fā)酵菌種的選育和評(píng)價(jià)工作,使更多優(yōu)良的菌種能夠最大限度作用于中藥,從而為更多有價(jià)值的發(fā)酵中藥產(chǎn)品的研制奠定基礎(chǔ)。-)現(xiàn)代復(fù)合微生物發(fā)酵技術(shù)
17、:多菌種發(fā)酵較單一菌種發(fā)酵具有更強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化能力,但也是發(fā)酵研究的難點(diǎn)。傳統(tǒng)中藥發(fā)酵多是自然界混合菌種天然發(fā)酵的結(jié)果,因那時(shí)人們并不知道微生物和發(fā)酵的關(guān)系,從而很難人為控制發(fā)酵過(guò)程。如何應(yīng)用現(xiàn)代微生物工程的相關(guān)技術(shù),進(jìn)行中藥多菌種發(fā)酵,提高發(fā)酵生產(chǎn)的可控性、穩(wěn)定性,提高發(fā)酵中藥的有效性和安全性,是進(jìn)行現(xiàn)代發(fā)酵中藥研究的又一關(guān)鍵技術(shù)。*)發(fā)酵中藥篩選模型和多維評(píng)價(jià)體系:中藥具有品種多樣性、化學(xué)成分復(fù)雜性、藥效作用多向性的特點(diǎn),中藥復(fù)方具有整體性、系統(tǒng)性、復(fù)雜性、非加和性等特點(diǎn)。因此,中藥及其復(fù)方在發(fā)酵過(guò)程中如何遵循中醫(yī)藥理論的指導(dǎo),進(jìn)行發(fā)酵后選用何種評(píng)價(jià)指標(biāo)和評(píng)價(jià)模型,建立發(fā)酵中藥篩選模型和多維
18、評(píng)價(jià)體系,是發(fā)酵中藥研究的又一技術(shù)難點(diǎn)。#結(jié)語(yǔ)中藥現(xiàn)代化研究已是一個(gè)醫(yī)藥、生物等眾多學(xué)科關(guān)心的課題。發(fā)酵中藥是現(xiàn)代生物技術(shù)和中藥研究的完美結(jié)合,在中藥新藥研究開(kāi)發(fā)中占有越來(lái)越重要的位置。發(fā)酵中藥也必將在中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力,為提高我國(guó)中藥行業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力,使中藥走向世界,造福人類(lèi)做出新的貢獻(xiàn)。作者簡(jiǎn)介:傅超美(#0$! ),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事中藥新制劑、新工藝與新劑型的研究,6 電子信箱 78,9:;<=>? #!$3 8:;;冷靜(#0)0 ),女,博士研究生,研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┡c新劑型,本文通訊作者,6 電話(huà) 7/!. $#./#$*$ 6電子信箱
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22、一個(gè)新領(lǐng)域"% &中藥新藥與臨床藥理,#.(,* + ( , / 0.&" #( %莊 毅&應(yīng)用藥用真菌新型固體發(fā)酵工程技術(shù)研制中藥一類(lèi)新藥的建議" % &中藥新藥與臨床藥理,#.),1 + 0 , / 0#&" #! %王玉紅,丁重陽(yáng),徐 鵬,等&中藥黃芪對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖的影響" % &食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),($),(0(():!*&" #0 %尤建良,趙景芳,章克昌,等&發(fā)酵型中藥生物制劑“康復(fù)靈”抑瘤實(shí)驗(yàn)研究" % &實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,($
23、),. + * ,:01 - 02&" #) %王貞佐,呼海濤3張 銳,等&中藥對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵的影響" % &食品科技,($1,!# + ( , / *&" #1 %任莉穎,劉 康,李宏婧&發(fā)酵炮制對(duì)紅花抗氧化活性的影響" % &中華臨床醫(yī)學(xué)雜志,($),1(*)/ 02&" #2 %李國(guó)紅,沈月毛,王啟方3等&發(fā)酵三七中的皂苷成分研究" % &中草藥,($),!1(0)/ 0.&" #* %王和英&五倍子的發(fā)酵炮制" % &a
24、mp;基層中藥雜志,($,#0(0)/ 0$&" #. %小橋恭一&中藥有效成分與腸道細(xì)菌的關(guān)系" % &醫(yī)學(xué)與哲學(xué),#.),#1(#):).*&" ($ %田天麗,王 嬙,王永宏3等&虎杖的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化及其發(fā)酵產(chǎn)物提取分離的研究" % &天然產(chǎn)物分離,($1,0 + 0 ,:# - 0&" (# %薛慧玲,徐萌萌,陽(yáng) 泰3等&黃芩微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取" % &天然產(chǎn)物分離3 ($),! + ) ,:) - 2,#&!收稿日期:"#$ %
25、#& % # (蛇毒是一種具有不同生物活性的蛋白質(zhì)和肽類(lèi)的復(fù)雜混合物3相對(duì)分子質(zhì)量在1 4 #$!5 #$ 4 #$!之間。蛇毒蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可歸為以下幾個(gè)蛋白質(zhì)超家族:絲氨酸蛋白酶家族、金屬蛋白酶家族、磷脂酶6((786()家族、凝集素家族、富含半胱氨酸蛋白質(zhì)家族和三指毒素家族。其中很多成分已用于疾病的診斷和治療,如! -銀環(huán)蛇毒素可用于診斷重癥肌無(wú)力及治療頑固性神經(jīng)痛、肌萎縮性側(cè)索硬化癥和復(fù)發(fā)性皰疹性角膜損傷等" # %,蛇毒類(lèi)凝血酶可有效治療血栓栓塞性疾病等" ( %。蛇毒蛋白的主要來(lái)源是捕蛇取毒后進(jìn)一步分離純化,這樣獲得的蛇毒蛋白成本高、周期長(zhǎng)、質(zhì)量難以控
26、制,長(zhǎng)期下去還會(huì)耗竭生物資源,破壞生態(tài)平衡。而且同種蛇毒的產(chǎn)地不同,其成分和作用就有可能不同,從而影響療效的評(píng)價(jià)。生物工程技術(shù)的縱深發(fā)展使蛇毒蛋白的規(guī)?;a(chǎn)成為可能,而且可以根據(jù)不同的目的對(duì)天然蛇毒蛋白基因進(jìn)行改造。早在#.)年,美國(guó)、法國(guó)和英國(guó)的科學(xué)家聯(lián)合克隆并表達(dá)非洲綠眼鏡蛇毒素基因,獲得了幾種具有與天然蛇神經(jīng)毒素同樣毒性的神經(jīng)毒素" ! %。隨后陸續(xù)不斷有用生物工程方法生產(chǎn)蛇毒蛋白的報(bào)道。盡管蛇毒蛋白基因工程表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴(kuò)大到酵母、昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞3但大腸桿菌仍是應(yīng)用最廣泛的蛇毒蛋白基因表達(dá)工具?,F(xiàn)將蛇毒蛋白基因的大腸桿菌表達(dá)策略作一介紹。&蛇毒蛋白目的基
27、因的獲取方法!" !從#$%&文庫(kù)中獲得蛇毒9:;6文庫(kù)包含了毒腺中全部的<=;6序列。根據(jù)目的蛋白的部分氨基酸或核苷酸序列設(shè)計(jì)寡核苷酸或核酸探針3利用核酸分子雜交+>?ABCD EF?A ,從9:;6文庫(kù)中篩選出含目的基因的克隆3然后利用聚合酶鏈反應(yīng)(7G=)方法擴(kuò)增出目的基因。!" 利用反轉(zhuǎn)錄(聚合酶鏈反應(yīng)()* ( +,))技術(shù)獲得將蛇毒腺細(xì)胞破碎提取總<=;63以總<=;6為模板反轉(zhuǎn)錄為9:;63利用7G=方法3以9:;6為模板擴(kuò)增出目的基因。毒蛇的種類(lèi)繁多,蛇毒蛋白成分及含量隨蛇種而異,即使是同一種蛇,受地區(qū)分布和周?chē)h(huán)境的影響,蛇
28、毒蛋白成分的<=;6在毒腺細(xì)胞總<=;6中的比例或豐度也會(huì)存在差異。從9:;6文庫(kù)中擴(kuò)增和利用=H - 7G=技術(shù)獲得目的基因均受<=;6豐度的影響。目的蛋白的<=;6在毒腺細(xì)胞中的拷貝越多,擴(kuò)增出的目的基因就會(huì)越多,而低豐度的<=;6會(huì)增加擴(kuò)增的難度。從中華眼鏡蛇毒腺9:;6表達(dá)文庫(kù)中成功擴(kuò)增了細(xì)胞毒素(GHI - !)和786(基因的9:;6,證實(shí)了GHI - !和786(<=;6在中華眼鏡蛇毒腺中豐度較高,GHI - !和786(在中華眼鏡蛇粗毒中含量豐富" 0 %。!" -人工合成在已知天然蛇毒蛋白全序列的情況下3根據(jù)大腸桿菌簡(jiǎn)并
29、密碼子的嗜好性可人工合成目的基因。對(duì)于小片段+小于0$ EJ ,的基因,采取互補(bǔ)鏈全部合成,先對(duì)合成的寡核苷酸片段進(jìn)行磷酸化,通過(guò)混合、退火實(shí)現(xiàn)正確匹配,再經(jīng)連接酶連接相鄰片段的!K和)K端而完成拼接過(guò)程。但基因序列長(zhǎng)度在2$ EJ以上時(shí),全基因合成不僅成本高,而且不容易控制好數(shù)目增多的寡核苷酸鏈的正確退藥學(xué)專(zhuān)論蛇毒蛋白基因的大腸桿菌表達(dá)研究進(jìn)展!孟文麗,許云祿+ 福建醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所,福建 福州!)$0 ,摘要:蛇毒是多種生物活性蛋白和多肽的混合物3由于蛇毒在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床上的特殊作用以及天然蛇毒蛋白獲取方法的局限性3采用生物工程方法規(guī)?;a(chǎn)高純度的蛇毒蛋白已成為當(dāng)前及今后的研究方向。該
30、文就蛇毒蛋白基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究近況進(jìn)行介紹。關(guān)鍵詞:蛇毒蛋白;大腸桿菌;基因表達(dá)中圖分類(lèi)號(hào):)*+, -;.+$-文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:/文章編號(hào):&#- % 0*1& !"#$ (& % #1 % #1)2324567 /894:62 ;< =:4>2 ?2:; A5;B2C: D2:2 EFG5233C;: C: /0 )1-#!"#$ %"#&( )* +*#&*, -"."/012 3#.44*4" 56 7#/8" 9"#5:( ;*</# !"=1/& >#?"
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