第14章 利用細菌生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)段愿

1、第十四章 利用細菌生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)摘要由于能源價格的上漲導致了化石能源的短缺和環(huán)保意識的增強，使得從可再生資源中獲取生物能源的需求急劇增加，特別是原油的需求。人們希望保留其流動性而不是旨在通過大規(guī)模的環(huán)境、經(jīng)濟和社會矛盾方面所付出的代價。因此，生物燃料的生產(chǎn)是很有前途的解決方案。本章節(jié)將討論的是用作生物燃料的油脂的菌類產(chǎn)物。例如脂肪酸甲基酯乙基酯這些酯基代替品，通常指定為生物柴油；這些酯表現(xiàn)出一些優(yōu)良特征，例如可生物降解，無毒，含硫量低和含芳香化合物少?，F(xiàn)在，各類的植物油通過化學上的堿性催化或者酶催化的酯交換反應生產(chǎn)的生物柴油，已經(jīng)被廣泛的作為可再生能源使用。用存在于細胞內(nèi)作為化合物的儲存的

2、微生物來源油來代替植物油的使用。在本章我們將會著重介紹體內(nèi)脂質(zhì)的合成和細菌的生產(chǎn)，同樣也會引入細菌?；D(zhuǎn)移酶對于甘油三酯和蠟酯生物合成的關(guān)鍵酶。我們將會回顧嘗試在大腸桿菌菌株中建立脂肪酸乙酯的形成和討論這個所謂微生物柴油的前景。前言生物技術(shù)生產(chǎn)的在細菌中存儲的化合物，例如聚羥基脂肪酸，特別是由于其可以生物降解使得利用率大大增加。一個突出的例子是3羥基丁酸和3羥基戊酸的共聚物，被英國帝國化學工業(yè)公司用做商業(yè)開發(fā)而且以“Biopol”為名字在市場上銷售。除了這些已經(jīng)被調(diào)查出的細菌儲存化合物，其它細胞內(nèi)的儲存化合物，例如藻青素，三?；视秃拖烏ヒ呀?jīng)成為了科學和生物工程上的青睞物。由于公眾意識到石油儲

3、量正在遞減，石油燃料氣體排放造成的環(huán)境惡化后果，能源價格特別是原油價格的上漲以及環(huán)保意識的提高使得燃料的代替品受到越來越廣泛的關(guān)注。因此，生物燃料的密集研究特別是生物柴油的研究已經(jīng)開始進行。生物柴油具有許多優(yōu)良的特征，比如它的可生物降解性，無毒性，含硫量低，含芳香化合物少以及由于它所獲得的可再生資源表現(xiàn)出的環(huán)境友好性。一般來說，三酰基甘油和游離脂肪酸分別通過酯交換（圖14.1A）和酯化作用（圖14.1B）和短鏈醇（例如甲醇）反應生產(chǎn)出生物柴油，例如脂肪酸甲酯和副產(chǎn)品甘油。酸根的長度取決于經(jīng)常以三?；视蜑榇淼闹|(zhì)的生物來源。來自不同來源的三?；视妥鳛樘娲剂嫌糜诓裼蜋C中在許多研究中都有描述

4、。AH2COCOR1 催化 R1OCOR H2COHHCOCOR2 ROH R2OCOR HCOHH2COCOR3 酯交換 R3OCOR H2COH 三酰基甘油 脂質(zhì) 甘油B 催化 HOOCR4 ROH R4 OCOR H2O 脂肪酸 醇類 酯化作用 脂質(zhì) 水圖14.1 三?；视秃陀坞x脂肪酸分別通過酯交換（A）和酯化作用（B）和短鏈醇反應生產(chǎn)出生物柴油。R1到R4代表脂肪酸側(cè)鏈，R代表醇側(cè)鏈。除了蠟酯和甾基酯外，三?；视瓦€作為中性脂質(zhì)出現(xiàn)在植物、動物、酵母菌、真菌和細菌內(nèi)。在植物中，三?；视妥鳛榧毎麅?nèi)主要的儲存脂質(zhì)出現(xiàn)在種子里。有趣地是，希蒙得木種子以長鏈蠟酯為儲存脂質(zhì)。動物身體細胞內(nèi)脂

5、質(zhì)的主要組分是三?；视秃顽藁ィ饕l(fā)生在肝細胞和脂肪細胞中。積累于酵母菌和絲狀真菌中的脂質(zhì)體類似于那些存在于植物和動物內(nèi)的脂質(zhì)。細菌同樣儲存了相當數(shù)量的脂質(zhì)比如三?；视秃顽藁?。因此，生物柴油可以通過油的來源和通過酯交換過程中的催化劑劃分為：（1）植物油、動物油、微生物油或廢油脂與脂肪同石化甲醇進行酯交換過程；（2）植物油、動物油、微生物油或廢油脂與脂肪通過脂肪酶、整個細胞或者生化醇類、石化醇類進行生物催化進行的酯交換過程；（3）微生物生物柴油產(chǎn)品，包括通過酯交換過程后醇類的合成。最后一種是自從Kalscheuer等等報道其合成而廣受關(guān)注從而被人認知的微生物柴油。堿+甲醇脂肪酸甲酯凈化生

6、物柴油（上層）植物，動物，微生物&廢油脂反應產(chǎn)物酯交換A固定化或者來自細菌酵母菌真菌的游離脂肪酶&醇類甘油甘油（下層）回收FAAE凈化生物柴油（上層）反應產(chǎn)物酯交換植物，動物，微生物&廢油脂甘油甘油（下層）B基體培養(yǎng)脂肪酸乙酯的提取與純化生物量FAAE油脂或脂肪酸&葡萄糖（微生物柴油原材料）脂肪酸乙酯的分離和廢棄物處理液體培養(yǎng)基補料分批發(fā)酵C圖14.2 不同種類的生物柴油通過脂質(zhì)的來源以及酒精在酯交換過程中的用途來加以區(qū)分。我們將生物柴油為（A）植物油，動物油，微生物油脂或者廢油脂與脂肪同石化甲醇進行酯交換過程；（B）植物油、動物油、微生物油或廢油脂與脂肪通過脂肪酶、整個細胞或者生化醇類、石化

7、醇類進行生物催化進行的酯交換過程；（C）微生物生物柴油產(chǎn)品，包括通過酯基交換過程后醇類的合成。制備生物柴油的油的酶酯基交換細胞外脂肪酶的使用已經(jīng)被用于生產(chǎn)生物柴油而廣泛研究，其目的是用來緩解堿催化的相關(guān)問題，例如廢甘油的生產(chǎn)和生物柴油的凈化。脂肪酸的不同來源用于甘油三酯與短鏈醇類通過酯交換反應生成烷基酯的探究。Shimada等報道，將甲醇逐漸加入到油脂中可以運用一種脂肪酸，這種脂肪酸是從固定在丙烯酸樹脂中的南極假絲酵母中獲得。在這種固定化系統(tǒng)下超過50次的作用會使得95%的甲基酯發(fā)生轉(zhuǎn)化因此要盡可能避免脂肪酸作用于甲醇。在另一篇報道中，Watanabe等在一種批量生產(chǎn)系統(tǒng)中運用南極假絲酵母超過

8、100天而不大量減少產(chǎn)量，使得甲基酯的含量增加至93%。非特異性酶的運用相較于配向性的脂肪酸顯示相對高的轉(zhuǎn)換率，這些酶不同于皺落假絲酵母、洋蔥假單胞菌和熒光假單胞菌，例如從稻根霉菌得到的脂肪酸。當從稻根霉菌得到的sn-1（3）配向性脂肪酸被運用后，甲酯根在甘油三酯的sn-1和sn-3位可以獲得而不能在sn-2位得到。這個發(fā)現(xiàn)反應了非特異性脂肪酸在生產(chǎn)生物柴油中的需求。制備生物柴油的油在整個細胞體系中的酶酯基交換許多研究報道，作為整個細胞生物催化劑的細菌、酵母菌和真菌的品種是用來加強酯交換過程的成本效益。在建立整個細胞生物催化體系中，絲狀真菌已經(jīng)被提升為工業(yè)酯交換和植物油甲醇分解應用最穩(wěn)健的全細

9、胞生物催化劑。在某些微生物細胞表面活性增強的異源表達膜結(jié)合脂肪酶已經(jīng)在不同的酯交換過程中得到應用。Matsumoto等從米根霉的脂肪酶中發(fā)掘了一種酵母菌細胞表面顯示系統(tǒng)。運用表面表達脂肪酶的一個主要優(yōu)點是它們在醇解中能夠簡單的進入到基底里，呈現(xiàn)出不必要的催化細胞預處理從而減少產(chǎn)品價格。其他的研究論述了細胞內(nèi)能產(chǎn)生脂肪酶并含異丙醇的酵母菌菌株的通透性，這種特性將進一步增加整個細胞生物催化的效率。然而，通過整個細胞催化的酯交換反應相比較于通過固定化脂肪酶進行體外催化的過程更耗時。一個優(yōu)秀的反應速度已經(jīng)分別由Watanabe和Samukawa等人對諾維信脂肪酶運用連續(xù)操作和流加操作而獲得，這種反應是

10、運用固定化脂肪酶進行的酯交換反應。相對而言，運用批次反應而進行的整個細胞生物催化的反應速度是相當?shù)偷?，而且這種進程所要求的時間分別超過72小時和165小時。因此探究出更又效率的全細胞生物催化正在進行當中。Tamalampudi等報道了絲狀米曲菌中含有來自南極假絲酵母的脂肪酶編碼基因的可能性，這個編碼基因是一個非常有效的全細胞生物催化劑，它在載生物質(zhì)顆粒上的固定化和在工業(yè)生物催化應用上的大大促進都發(fā)生在水溶液和非水溶液介質(zhì)中。此外，非特異性脂肪酶的異性表達例如南極假絲酵母和洋蔥假單胞菌脂肪酶，以及耐甲醇脂肪酶的異性表達可能會導致全細胞生物催化重組的發(fā)展以及允許更多植物油的有效酯交換。然而，種類繁

11、多的可再生植物油已經(jīng)主要被運用在通過化學堿催化或者酶催化進行酯交換從而得到生物柴油。商業(yè)化的堿催化酯交換需要較高的溫度（160-180），同時需要更高的脂肪酶消耗，最常用的酶催化往往是那些節(jié)約能量的。生物柴油生產(chǎn)的主要花費是與油基的花費相關(guān)的。此外，可再生植物油的運用引起了社會問題，因為這些生物柴油原料的培養(yǎng)往往與食物和飼料的培養(yǎng)相競爭。微生物柴油生產(chǎn)的首要問題是找到合適的微生物菌株，這些菌株能夠重新過度生產(chǎn)出三?；视突蛘呦烏ァＷ罱鼛啄?，微生物脂質(zhì)的積累已經(jīng)作為單細胞油脂的產(chǎn)品來研究，特別是作為微生物柴油的產(chǎn)品來研究。眾多含油細菌、真菌、酵母菌和微藻已經(jīng)被報道為用來增加和累積大量脂質(zhì)，類似于

12、植物油、甲基酯、肥皂一樣用做唯一碳源和能量來源。在此背景下，用做非食品類產(chǎn)品的細菌作為碳源來轉(zhuǎn)化三酰基甘油有可能被用來改變生物柴油的產(chǎn)品機體。細菌中中性存儲脂質(zhì)的功能和發(fā)生微生物中積累的大量的三酰基甘油主要來源于放線菌，尤其是分支桿菌，諾卡氏菌，紅球菌屬，迪茨氏菌，戈登氏菌，小單孢菌和鏈霉菌。產(chǎn)三?；视偷奈⑸镆呀?jīng)有報道是革蘭氏陰性菌類，然而相對于產(chǎn)蠟酯的微生物來說數(shù)量是有限的。三酰基甘油在這些細菌中主要在球形脂體中積累；而其數(shù)量和面積取決于菌種的種類，生長階段以及培養(yǎng)條件（表14.A）。在這些種類中，紅球菌屬PD630存儲的三?；视湍苓_到占細胞干重的89%，并且這些細胞里面幾乎都是直徑為

13、50到400nm的油脂體（圖14.3）。這些油脂體主要組成部分為三酰基甘油（87%），甘油二酯（約5%），游離脂肪酸（約5%）,磷脂質(zhì)（1.2%）,以及蛋白（0.8%）。三酰基甘油的主要成分為棕櫚酸，油酸（19.1%），以及相當大量的奇數(shù)脂肪酸殘留物類似于十七烷酸，（11.4%）和十七碳烯酸（10.6%）圖14.3 脂質(zhì)體存在于不透明紅球菌PD630細胞內(nèi)的電子顯微照片。細胞包含了幾個電子透明脂質(zhì)體（ET1），顯示了一個細小的邊界膜（B）。表14.A 細菌中三?；视偷纳桑@示了每個細菌用來轉(zhuǎn)化成三?；视偷奶荚春腿；视秃考毦荚锤视腿ズ繀⒖嘉墨I革蘭陽性細菌Dietza maris

14、醋酸 十六烷19.2%（cdw）aAlvarez,2003Gordonia amarae葡萄糖酸 十六烷6.1%（cdw）aAlvarez,2003Micromonospora echinospora葡萄糖8.0%（cdw）aHoskisson et al., 2001Mycobacterium avium棕櫚酸5.0%（cdw）aBarksdale & Kim, 1977M.ratisbonense角鯊烯n.r.M.Berekaa & A.steinbuchel, unpublished dataM.smegmatis復合培養(yǎng)基n.r.Akao & Kusaka, 1976M.tubercu

15、losis含甘油培養(yǎng)基n.r.Barksdale & Kim, 1977Nocardia asteroides葡萄糖酸 十五烷12.2%（cdw）aAlvarez,2003N.corallina十六烷 氣油23.9%（cdw）aAlvarez et al., 1997aN.globerula葡萄糖酸 十六烷 老鮫烷18.6%（cdw）aAlvarez et al., 2001; Alvarez,2003N.restricta葡萄糖酸 十六烷 19.3%（cdw）aAlvarez,2003Rhodococcus erythropolis葡萄糖酸 十五烷 十六烷 戊酸21.0%（cdw）aAlva

16、rez et al., 1997a; Alvarez,2003R.fascians葡萄糖 十五烷 十六烷 戊酸18.1%（cdw）aAlvarez et al., 1997a; Alvarez,2003R.opacus葡萄糖酸 果糖 醋酸 檸檬酸 琥珀酸 丙酸 戊酸 苯乙酸 橄欖油 苯癸烷 正烷烴87.0%（cdw）aAlvarez et al.,1996, 1997a, 2003R.ruber葡萄糖 醋酸鹽 檸檬酸 戊酸 十五烷 十六烷26.0%（cdw）aAlvarez et al.,1997aRhodococcus sp. Strain 20 葡萄糖酸 十六烷8.1%（cdw）aAlva

17、rez, 2003 streptomyces coelicolor復合培養(yǎng)基84 mg/ml mediumbOlukoshi & Packter, 1994;Karandikar et al., 1997S.lividans復合培養(yǎng)基125 mg/ml mediumbOlukoshi & Packter, 1994S.albulus復合培養(yǎng)基56 mg/ml mediumbOlukoshi & Packter, 1994S.griseus復合培養(yǎng)基93 mg/ml mediumbOlukoshi & Packter, 1994革蘭陰性菌Acinetobacter calcoacetius st

18、rain BD413十六烷4.0%（cdw）aReiser & Somerville, 1997A.lwofh十六烷+醇類16 ug/mg proteinbVachon et al.,1982Acinetobacter sp. Strain H01-N十六烷 十六醇1.9%（cdw）aMakula et al.,1975;Scott & Finnerty,1976;Singer et al.,1985Acientobacter sp. Stain 211醋酸 醇類 橄欖油25.0%（cdw）aAlvarez et al.,1997bPseudomonas aeruginosa strain 4

19、4T1葡萄糖 正烷烴 橄欖油38.0%（cdw）aDe Andres et al.,1991其它細菌Nostoc commune復合培養(yǎng)基n.r.Taranto et al.,1993蠟酯主要積累于不動桿菌烷烴和芳香烴的培養(yǎng)中，同時少量的積累于莫拉克斯氏菌、微球菌、石油降解菌。屬于石油降解菌、分支桿菌、棒狀桿菌類得放線菌種同樣也被用作為累積蠟酯。異戊間二烯蠟酯已經(jīng)被鑒定為海桿菌種類。在這些菌種中，不動桿菌株ADP1和醋酸鈣不動桿菌株HO1-N可以儲存占細胞干重25%的蠟酯，然而只有一個或幾個蠟酯體能在平均直徑200nm的單個細胞中顯示?；瘜W分析顯示，這些蠟酯體由十六酸十六酯（85.6%）、十六

20、醇（4.8%）和磷脂酶（9.6%）組成。有趣的是，不同種類的不動桿菌和石油降解菌從烷烴中合成細胞外蠟酯，而且這些細胞外蠟酯的功能和它們的出口體制正在探究進行中。在細菌中，作為碳源和能量儲存化合物的中性儲備脂質(zhì)可以在缺乏的碳源和含其他必要的補充物中流動。例如，三?；视涂梢杂芍久杆獬筛视秃椭舅?。甘油然后被磷酸化和氧化為磷酸二羥丙酮，最后以糖酵解途徑被異化。一般來說，脂肪酸被轉(zhuǎn)化為輔酶A酯以及發(fā)生-氧化形成乙酰輔酶A。后者是在三羧酸循環(huán)中或者使用合成代謝進一步異化。因此，脂質(zhì)的積累在缺乏營養(yǎng)的環(huán)境下自然生存下去是有優(yōu)勢的?？梢哉J為游離脂肪酸擁有膜破壞潛力，他們并入無毒存儲化合物保護細胞免受這

21、些分子的高細胞濃度破壞。此外，已經(jīng)提出了一種適應干燥的方法，在脫水的條件下脂質(zhì)碳氫鍵的氧化會產(chǎn)生相當數(shù)量的水，從而有助于細胞存活。致病細菌，例如結(jié)核分枝桿菌，同樣可以積累三?；视停藗冇懻摿嗽诎l(fā)病機理中三?；视托玛惔x的可能影響。細菌及相關(guān)酶類中性儲存類脂的生物合成（過程）細菌和真核生物將碳和能量作為中性儲存類脂來儲存，例如，三?；视秃拖炛鼈兎謩e由酯化甘油分解成的三脂肪酸和酯化脂肪醇分解成的脂肪酸組成。用還原性輔酶II作還原劑，底物乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A在脂肪酸合成酶混合物的催化作用下，可以再度合成脂肪酸。輔酶A中的乙酸鹽和丙二酸鹽轉(zhuǎn)化成?；d體蛋白中的硫基后，脂肪酸就會再度合

22、成。在這個兩級反應過程中，兩個C原子被加在了在合成酶混合物作用下增長的脂肪酸鏈上，直到被酰基載體蛋白承載的脂肪酸鏈增長到合適的長度，反應才會停止。生成的脂肪酸會附著在會引起糖酵解的中間產(chǎn)物二羥丙酮磷酸的還原反應的甘油上，或者脂肪醇上。而該物質(zhì)是由?；o酶A和烴類發(fā)生還原反應分別生成TAG或者蠟脂而來。與細菌不同的是，真核生物有催化長鏈殘留?；D(zhuǎn)化的專業(yè)酶類，這些酰基被催化后產(chǎn)生TAG或者蠟脂。相比細菌，在合成TAG或者蠟脂時，脂肪酰轉(zhuǎn)移酶的催化作用更占優(yōu)勢。這些酶類的底物特異性很低，因此可以作為受體分子大范圍地接受多種物質(zhì)，允許像TAG和蠟脂這樣結(jié)構(gòu)大不相同的物質(zhì)生物合成。這種催化反應要求這種

23、酶類的成員是確定的:甘油二脂，WS. 體外實驗表明：從ADP1菌株中提取出來的純的WS也含有酰基輔酶A：單酰甘油（圖14.4）。脂肪酰轉(zhuǎn)移酶優(yōu)先跟甘油酯上sn-1及sn-2羥基發(fā)生反應，而不是sn-2.像從乙醇到三十烷醇這樣的WS酰化線性醇類跟中等鏈長的正十四醇到十八烷反應時活性最高。鏈長越長，酶的活性越低。因此伯醇就比仲醇更易發(fā)生反應。為鑒定WS的特殊性，?；o酶A硫醇中，從C2到C20有一定碳鏈長度系列酰基被檢測。結(jié)果表明從C14到C18這樣長度的酰基活性最高。舉個例子，像環(huán)己醇或苯基乙醇這種循環(huán)芳香族醇被WS的?；妥C實了后者的非特異性。對WS族中細菌的脂肪酰轉(zhuǎn)移酶做了進一步的鑒定，例

24、如，結(jié)核桿菌H37Rv, SK2,海洋桿菌屬DSM8798，菌株P(guān)D630，以及天藍色鏈霉菌。這些菌株都被放置在一個寬闊的培養(yǎng)基內(nèi)，然而，底物不同，反應的程度也不同。圖14.4 A:甘油二酯酶轉(zhuǎn)移反應 B：蠟酯合成酶反應幾乎WS族的所有成員以及分支桿菌中的PAP都含有高度的保守基序，它在?；磻衅鸬酱呋；o酶A的作用。這表明，作為基本催化劑的保守組織胺殘基分別將脂肪醇和DAG中的羥基去除質(zhì)子化。然后對脂肪?；o酶A分子的硫脂鍵進行親核攻擊，從而形成氧化鍵并且把質(zhì)子轉(zhuǎn)移給輔酶A，形成質(zhì)子化了的組織胺殘基的再生過程。有趣的是，WS跟DGAT1和DGAT2中的真核生物以及從加州希蒙得木中提取出來

25、的蠟脂合酶沒有序列同系性。與有專業(yè)膜蛋白質(zhì)的真核WS酶相比，原核的WS酶更具有兩親性。并且原核的WS酶是通過靜電作用松散的依附在膜蛋白質(zhì)上。抗菌中性油脂生產(chǎn)的調(diào)查在細菌中，作為碳源和能量儲存化合物的中性儲備脂質(zhì)僅僅累積于某些培養(yǎng)條件下?；鞚峒t球菌和鏈霉菌含有極少的三?；视彤斔鼈儽慌囵B(yǎng)在高含量的碳和氮介質(zhì)中時，當細胞在一個低氮碳比的礦物鹽中，脂肪含量和三酰基甘油體數(shù)將會大大增加，這種礦物鹽產(chǎn)生了它們在后期平穩(wěn)增長階段的最高產(chǎn)量。Voss和Steinbuchel研究了三?；视偷陌l(fā)酵法生產(chǎn)，這種三?；视瓦\用了混濁紅球菌株P(guān)D630并由低碳消耗的甜菜糖漿和蔗糖中得到。在30的攪拌式生物反應器中進

26、行30L和50L流加操作發(fā)酵，分別得到含52%三酰基甘油的細胞干物質(zhì)37.5g/L和含38.4%三?；视偷募毎晌镔|(zhì)18.4g/L。Mona等通過對比大頭藻菌DG與混濁紅球菌PD630研究了脂質(zhì)的積累，這種積累運用了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的殘留物和廢棄物來作為碳源，比如甘蔗糖漿、角豆樹和橘子樹廢棄物。作為碳源的橘子樹廢棄物的運用產(chǎn)生了菌株和增加的不飽和脂肪的最大脂質(zhì)含量，混濁紅球菌中不飽和脂肪酸含量為18:3，大頭藻菌DG中含有22:0和6:0的主要脂肪酸。然而，在這項工作中沒有考慮到原來的原料中脂質(zhì)或者脂肪酸的可能含量，而且如果作者所報道脂質(zhì)含量超過95%的細胞干重成立，這將擁有所有記錄的油脂微生物最高

27、的價值。因此，衡量野生型菌株脂質(zhì)的生產(chǎn)是靠所用的菌株、培育條件、所用的碳源以及氮碳比。為了在工業(yè)上生產(chǎn)生物技術(shù)的產(chǎn)品，那些能夠檢測出合適的菌株以及培育環(huán)境的優(yōu)秀研究必須開始執(zhí)行了。還有種方法探究了細菌的代謝工程，這些細菌運用了各自的代碼酶參與到容易理解的脂質(zhì)合成中。通過大腸桿菌株進行微生物柴油生產(chǎn)的工程大腸桿菌經(jīng)過自然的新陳代謝不會產(chǎn)生脂肪酸乙酯，在厭氧混合酸發(fā)酵中相比其他發(fā)酵產(chǎn)品只會產(chǎn)生醇類。該醇類是由乙酰基輔酶A與2個連續(xù)的依賴性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）進行還原所合成并由多功能醇類脫氧酶催化。大腸桿菌在厭氧條件下自然生成的醇類含量不能完全支持酯交換過程中大量脂肪酸乙酯的形成。來自于

28、運動發(fā)酵單胞菌的基因編碼的NADH-氧化系統(tǒng)異源表達于大腸桿菌中。發(fā)生在運動發(fā)酵單胞菌中的NADH-氧化途徑包括2種分別由2中酶催化的反應。丙酮酸脫酸酶催化非氧化丙酮酸脫酸生成乙醛和CO2。醇類脫氫酶同工酶催化發(fā)酵過程中乙醛到醇類的還原部分，伴隨著NADH到NAD的氧化。大量的醇類產(chǎn)生于有氧環(huán)境，此環(huán)境有利于酯交換過程和脂肪酸乙酯的合成。正如我們提到的，微生物脂肪酸乙酯為了微生物柴油生產(chǎn)所進行的生物合成基于WS/DGAT（來自于不動桿菌ADP1）極低底物特異性的開發(fā)。因此，Kalscheuer等構(gòu)建了一個重組質(zhì)粒叫做pMicrodiesel，它含有三個基因atfA，pdc和adhB，在2個la

29、cZ基因推動者的控制下確保了WS/DGAT、丙酮酸脫羧酶、醇類脫氫酶有效的轉(zhuǎn)錄以及表達。這些代謝工程菌產(chǎn)生了大量的醇類和能夠表達的WS/DGAT，為轉(zhuǎn)移酶提供了一個不同尋常的替代基板。后者運用這種醇類作為?；荏w，盡管它的運作沒有天然底物甘油更有效率并產(chǎn)生出大量的脂肪酸乙酯。圖14.5顯示了脂肪酸乙酯（來自糖類）在體外合成的方案。有機物質(zhì)和木質(zhì)纖維廢棄物A微生物的新陳代謝工程糖類木質(zhì)素半纖維素纖維素葡萄糖果糖小型糖戊糖簡單糖類通過工程細胞的吸收產(chǎn)生脂肪酸和醇類圖14.5中試規(guī)模種植微生物柴油菌株運用大腸桿菌菌株設(shè)計的脂肪酸乙酯生物合成嚴格依賴于出現(xiàn)在介質(zhì)中的油酸鈉。介質(zhì)中添加了0.2%（w/v

30、）的油酸鈉作為脂肪酸的來源以及2%（w/v）生產(chǎn)醇類的葡萄糖。在大腸桿菌菌株的有氧補料培育過程中，脂肪酸乙酯在整個培育中不斷增加，干細胞體從開始的1.3g/L增加到72小時后的4.9g/L。這個發(fā)現(xiàn)相當于脂肪酸乙酯含量的26%（w/w）。形成的脂肪酸乙酯積累在細胞內(nèi)，沒有大量的脂肪酸乙酯出現(xiàn)在非細胞上清液。最近，Elbahloul和Steinbchel將含有pMicrodiesel的大腸桿菌培育在20L的流加式反應器中。濃度約60g/L的細胞中可獲得高達25%（w/w）的脂肪酸乙酯。這份研究的一個有趣觀點是將甘油作為碳源來使用。自從甘油被認為是種副產(chǎn)品或者生物柴油生產(chǎn)的剩余物以來，它在生物柴油生產(chǎn)上的利用將在未來得到更大的興趣。在發(fā)酵過程中達到適當?shù)脑鲩L量后，葡萄糖和油酸或者油酸鈉被添加到礦物鹽中，從而開始積累脂肪酸乙酯。由于醇類脫氫酶的活性以及油酸通過WS/DGAT的活性被酯轉(zhuǎn)移，葡萄糖被轉(zhuǎn)化為醇類。下層的微生物柴油加工開始于離心細胞的獲得。然后，細胞被有機溶