生物技術(shù)在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

1、生物技術(shù)在疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)是直接操作有機(jī)體細(xì)胞和基因的一種全新技術(shù)，已從七十年代純學(xué)術(shù)性研究的分子生物學(xué)領(lǐng)域，發(fā)展成為解決農(nóng)業(yè)、醫(yī)療保健、環(huán)境保護(hù)等眾多社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題的重要手段。特別是近十年來(lái)，在全球HGP計(jì)劃的推動(dòng)下，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物、克隆技術(shù)等方面的研究取得了突破性進(jìn)展，為生物技術(shù)在預(yù)防性和治療性疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，帶來(lái)了無(wú)限光明的前景。疫苗是目前醫(yī)學(xué)上最有潛力的防御性物質(zhì)，它可在接受者體內(nèi)建立起對(duì)入侵物質(zhì)感染的免疫抗性，從而免受疾病侵染。經(jīng)典的疫苗主要是滅活和減毒的致病微生物，其生產(chǎn)方式存在著成本高、疫苗有效期短、運(yùn)輸不便等明顯缺點(diǎn)。從本世紀(jì)八十年代中期以來(lái)，隨

2、著DNA克隆重組技術(shù)的日益成熟，特別是基因工程的發(fā)展，人們開發(fā)生產(chǎn)新疫苗的有效途徑大為拓展。1 基因工程疫苗基因工程疫苗指的是用基因工程的方法，表達(dá)出病原物的特定基因序列，將表達(dá)產(chǎn)物(多數(shù)是無(wú)毒性、無(wú)感染能力，但具有較強(qiáng)的免疫原性)用作疫苗。如將乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因轉(zhuǎn)移到痘病毒基因組中，當(dāng)將這種重組病毒接種到人或動(dòng)物身體上就會(huì)產(chǎn)生許多乙肝表面抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)乙肝病毒的抵抗能力?；蚬こ桃呙缡职踩?，避免了常規(guī)疫苗存在的許多明顯缺點(diǎn)?；蚬こ桃呙缰饕幸韵聨追N類型：11 亞基疫苗。它是利用病原物結(jié)構(gòu)的某一部分(即亞基)制得的疫苗。目前成功的例子較多，具有代表性的是單純皰疹病

3、毒疫苗、口蹄疫病毒疫苗、人乙型肝炎病毒疫苗等。這些疫苗生產(chǎn)的基本原理是：首先鑒定出病原物中哪些成分能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體，如單純皰疹病毒1型(HSV1)衣殼糖蛋白D(gpD)、口蹄疫病毒衣殼蛋白1(VP1)等，再分離出編碼該蛋白亞基的基因，然后轉(zhuǎn)移到特定的載體DNA大腸桿菌質(zhì)粒DNA上，再大量增殖大腸桿菌，在菌體溶解后，就可獲得大量相應(yīng)的病毒蛋白亞基，將這些病毒蛋白亞基純化，并與輔劑混合，就能生產(chǎn)大量該病毒的亞基疫苗。除了用質(zhì)粒大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)亞基疫苗外，近幾年來(lái)，桿狀病毒昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)已被普遍接受為用于表達(dá)異源基因最佳表達(dá)系統(tǒng)之一。如在該系統(tǒng)中表達(dá)的人乙型肝炎病毒表面抗原蛋白已與相應(yīng)的天然蛋白結(jié)

4、構(gòu)非常類似，而且產(chǎn)量也相當(dāng)理想。用這一系統(tǒng)表達(dá)的畜禽病原體疫苗研究也已取得成功，如狂犬病毒糖蛋白亞基、藍(lán)舌病毒的不同結(jié)構(gòu)蛋白亞基、雞新城疫病毒血凝素神經(jīng)氨酶、雞馬立克病毒的與腫瘤相關(guān)的磷蛋白等均已在該系統(tǒng)中得到成功表達(dá)。此外，在抗細(xì)菌疫苗中，抗洛基山出血熱的亞基疫苗已研制成功，免疫避孕疫苗的亞基疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，抗瘧原蟲的多亞基重組疫苗也已研制成功。12 肽疫苗。引起免疫反應(yīng)的病原微生物各部分并不都起相同的作用，往往只有部分結(jié)構(gòu)物質(zhì)起決定作用，稱抗原決定簇。如病毒顆粒，只有位于病毒衣殼外表可以與抗體結(jié)合的蛋白，其結(jié)構(gòu)域才能引起免疫反應(yīng)，像這種類似于抗原決定簇的小肽用作的疫苗稱肽疫苗。最先研究

5、的肽疫苗是口蹄疫肽疫苗。口蹄疫是一種可借空氣傳播的在豬、牛中引起嚴(yán)重感染的重要傳染病，是世界畜牧業(yè)生產(chǎn)中危害最大的疾病。研究人員發(fā)現(xiàn)，口蹄疫病毒衣殼蛋白1(VP1)的141160肽段在豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生了足以抵御口蹄疫病毒感染的抗體，而完整的衣殼蛋白1以及其它肽段在豚鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平則相對(duì)較低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，把141158和200213兩個(gè)肽段連接起來(lái)，形成一個(gè)較長(zhǎng)的肽，然后免疫豚鼠，可以激發(fā)豚鼠產(chǎn)生高水平的抗體，在牛體內(nèi)的試驗(yàn)，也有同樣的效果，這樣的肽段將有可能成為預(yù)防口蹄疫的有效疫苗?？汞懺x疫苗也是人們研究的熱點(diǎn)之一。由于瘧原蟲引起嚴(yán)重威脅人類健康的瘧疾，尤其在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病嚴(yán)重，而且瘧

6、原蟲培養(yǎng)困難，抗原成分復(fù)雜。因此，人工合成的肽疫苗和基因工程重組肽疫苗可能是研制抗瘧原蟲疫苗的理想途徑。目前，在該領(lǐng)域內(nèi)人類已經(jīng)獲得四處人工合成的肽疫苗，三種基因工程肽疫苗。另外，免疫避孕疫苗中，也有一種肽疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，抗腫瘤的熱休克蛋白肽復(fù)合體疫苗也已研制成功。對(duì)于肽疫苗來(lái)說(shuō)，還有許多研究和改進(jìn)的工作要做。相信在不久的將來(lái)，合成肽疫苗會(huì)以其高度的特異性，低廉的價(jià)格及良好的免疫原性，將會(huì)成為傳統(tǒng)疫苗的有效替代品。13 活體重組疫苗?；铙w重組疫苗已成為新一代疫苗的重要組成部分，它是指利用基因工程的原理和方法，對(duì)一些細(xì)菌和病毒進(jìn)行改造、重組，形成具有特定免疫原性的疫苗。這類活體重組疫苗可以是非

7、致病性微生物，通過(guò)基因工程的方法，讓它攜帶并表達(dá)某種特定病原物的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性；也可以本來(lái)是致病性微生物，通過(guò)基因工程的方法修飾或去掉毒性基因以后，仍保持免疫原性，后者又稱為弱毒疫苗。一般的活體重組疫苗都需要用減毒的、溫和的病原物作為載體，載體的主要功能是運(yùn)送和表達(dá)編碼外源的抗原基因。根據(jù)載體的不同，通常將能在寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的含有病原基因組和質(zhì)粒的載體稱復(fù)制性載體，如目前常用的痘苗病毒載體、門哥病毒載體、麻疹病毒載體等；而那些免疫接種哺乳動(dòng)物乃至人類，或感染非禽類細(xì)胞或細(xì)胞系后，只能進(jìn)行早期復(fù)制及基因表達(dá)，而不能裝配形成子代病毒并釋放出來(lái)的載體則稱為非復(fù)制性載體，如非復(fù)制性禽痘病

8、毒載體、金絲雀痘病毒載體及非復(fù)制性人類腺病毒載體等。在復(fù)制性載體疫苗中，霍亂活體疫苗的研究較有代表性。人們利用DNA重組破壞了霍亂弧菌腸毒素，成為非致病菌，但仍具有與致病性霍亂菌相同的其它生物化學(xué)性質(zhì)，可以用作活體疫苗。目前，能夠在重組痘苗病毒載體中表達(dá)的外源基因已有幾十種，在門哥病毒、流感病毒、麻疹病毒等載體中表達(dá)的外源基因也有多種。有些作為治療性疫苗已開始臨床應(yīng)用，特別是在治療腫瘤方面，如利用痘苗病毒載體表達(dá)的一種廣泛存在于結(jié)腸癌、胃癌、肺癌等細(xì)胞中的特異性抗原CEA的活體重組疫苗、廣譜黑色素瘤的多價(jià)黑色素抗原制備的活體重組疫苗等。此外，治療乙型肝炎、麻風(fēng)病等活體重組疫苗也在試驗(yàn)階段。最近

9、，非復(fù)制性金絲雀痘狂犬病毒重組疫苗的構(gòu)建成功和人體初免試驗(yàn)取得良好效果，引起了廣泛關(guān)注。弱毒疫苗中，豬的偽狂犬病毒疫苗已獲美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)，投放市場(chǎng)。14 多價(jià)疫苗。多價(jià)疫苗是指一種病毒帶有兩種以上的不同病毒的基因，一次免疫就可預(yù)防二種以上疾病。其原理是在一條DNA或RNA鏈上，切除某段對(duì)寄主細(xì)胞有害的或不必要的基因，插入編碼兩種以上抗原的基因，在感染動(dòng)物或人體時(shí)，可以同時(shí)產(chǎn)生兩種以上的抗體，來(lái)預(yù)防兩種以上的疾病。隨著活體重組疫苗水平的提高，多價(jià)疫苗成為可能。英國(guó)成功地研制出仔豬三聯(lián)疫苗，用于斷乳仔豬抗胸膜炎嗜血桿菌、豬萎縮性鼻炎和豬丹毒病的聯(lián)合防疫，效果好，使用方便。我國(guó)也成功研制出仔豬腸毒素

10、大腸桿菌的基因工程雙價(jià)苗，并已出口海外。2 基因疫苗1990年Wollf等人意外地發(fā)現(xiàn)將DNA直接注射入小鼠骨骼肌細(xì)胞后，可引起特異性的免疫反應(yīng)。這種直接給動(dòng)物(包括人類)接種編碼抗原的基因片段，可使該動(dòng)物獲得對(duì)抗原的免疫能力，達(dá)到免疫接種的目的，具有疫苗功能，稱為基因疫苗或核酸疫苗。通常接種的核酸(DNA或RNA)，它既是基因載體，又是抗原來(lái)源。目前研究最多的是DNA疫苗，主要針對(duì)一些危害較大的流行病、傳染病。盡管人們對(duì)基因疫苗的作用機(jī)制尚不清楚，但對(duì)其研究已經(jīng)展開，在某些方面已取得令人鼓舞的進(jìn)展。21 流感DNA疫苗。1993年Robinson直接將編碼流感病毒血凝素的DNA克隆到表達(dá)載體

11、中，肌注小雞和小鼠，結(jié)果這些動(dòng)物產(chǎn)生了抗流感病毒血凝素特異性抗體，并能抵抗致死劑量流感病毒的攻擊。還有科學(xué)家將流感病毒的核蛋白抗原基因克隆到質(zhì)粒中，制備DNA疫苗，注射到小鼠肌細(xì)胞后，產(chǎn)生多種亞型的殺傷性T細(xì)胞；在致死劑量的同型病毒異源毒株的攻擊下，免疫小鼠存活率達(dá)90，對(duì)照組的存活率只有20。22 狂犬病DNA疫苗。1994年Xing等將編碼與致病性有關(guān)的狂犬病毒糖蛋白的cDNA插入質(zhì)粒DNA，用該質(zhì)粒DNA直接注射小鼠腓腸肌，免疫三次后，小鼠產(chǎn)生了特異性抗體和淋巴細(xì)胞。用半致死劑量的病毒攻擊，結(jié)果均獲完全保護(hù)。23 乙肝DNA疫苗。Davis和Whalen的實(shí)驗(yàn)證明用含乙型肝炎表面抗原(H

12、BsAg)及preS基因并有真核細(xì)胞啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠，可誘生抗體和致敏淋巴細(xì)胞。在黑猩猩中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了乙肝DNA疫苗的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，這類疫苗不僅可預(yù)防乙型肝炎和丙型肝炎病毒的感染，而且極有可能發(fā)展成為可供治療乙肝、丙肝患者的治療性疫苗。24 結(jié)核病DNA疫苗。1994年Lowrie等用含與結(jié)核桿菌抗原非常相似的麻風(fēng)桿菌的熱休克蛋白基因的質(zhì)粒DNA免疫小鼠，結(jié)果表明DNA免疫與常規(guī)卡介苗有相似的保護(hù)作用。25 瘧疾DNA疫苗。1994年Sedegagh等構(gòu)建了含有編碼尤氏瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白基因的質(zhì)粒，該疫苗有較明顯的抗感染作用。最近的研究表明，這類瘧疾基因疫苗有可能成為最早用于人類的抗蟲基因疫苗。此外，文滋病DNA疫苗、單純皰疹病毒DNA疫苗，丙型肝炎DNA疫苗的研究也有一