木鱉子提取物通過調(diào)節(jié)MAPKs通路

1、 木鱉子提取物通過調(diào)節(jié)木鱉子提取物通過調(diào)節(jié)MAPKs通路通路 誘導(dǎo)黑色素瘤誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞分化的實驗研究細(xì)胞分化的實驗研究研究背景（一）研究背景（一） 目前認(rèn)為，腫瘤的形成同細(xì)胞分化異常有關(guān)，即腫瘤細(xì)胞不能目前認(rèn)為，腫瘤的形成同細(xì)胞分化異常有關(guān)，即腫瘤細(xì)胞不能進(jìn)行正常分化，或是分化能力降低，從而導(dǎo)致腫瘤克隆的形成。進(jìn)一步的研進(jìn)行正常分化，或是分化能力降低，從而導(dǎo)致腫瘤克隆的形成。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞有可能在適當(dāng)?shù)拇碳は卤徽T導(dǎo)分化，使之向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變。究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞有可能在適當(dāng)?shù)拇碳は卤徽T導(dǎo)分化，使之向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變。在特定藥物作用下，惡性腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞演變分化，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)、生

2、在特定藥物作用下，惡性腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞演變分化，表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和生物化學(xué)諸標(biāo)志物方面向正常細(xì)胞接近，甚或轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞，這種物學(xué)和生物化學(xué)諸標(biāo)志物方面向正常細(xì)胞接近，甚或轉(zhuǎn)變?yōu)檎＜?xì)胞，這種現(xiàn)象即稱為腫瘤的誘導(dǎo)分化（現(xiàn)象即稱為腫瘤的誘導(dǎo)分化（differenation）或再分化、腫瘤逆轉(zhuǎn)。這些能或再分化、腫瘤逆轉(zhuǎn)。這些能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的化學(xué)物質(zhì)稱為分化誘導(dǎo)劑。夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的化學(xué)物質(zhì)稱為分化誘導(dǎo)劑。“誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化”概念的提出，為腫瘤治療提供了一個新的治療途徑。它是針對概念的提出，為腫瘤治療提供了一個新的治療途徑。它是針對腫瘤細(xì)胞特異性殺傷，而不損傷正常人體組織細(xì)胞的藥物，也

3、是腫瘤治療方腫瘤細(xì)胞特異性殺傷，而不損傷正常人體組織細(xì)胞的藥物，也是腫瘤治療方面一個較好的，具有潛力的方向。面一個較好的，具有潛力的方向。腫瘤的分腫瘤的分化治療化治療黑色素瘤（黑色素瘤（melanoma）Treatment-resistantMedian survival :6-9monthNormal chemotherapy protocolnew drugs or novel therapyInformation is limitedEarly invasion and metastasis Differentiation inducer研究背景（二）研究背景（二）黑色素瘤細(xì)胞是研究腫瘤

4、細(xì)胞分化的理想模型黑色素瘤細(xì)胞是研究腫瘤細(xì)胞分化的理想模型 Add your title in here黑色素瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化后，出現(xiàn)典型的樹突狀突起結(jié)構(gòu)，黑色黑色素瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞分化后，出現(xiàn)典型的樹突狀突起結(jié)構(gòu)，黑色素生成及酪氨酸酶活性增加。素生成及酪氨酸酶活性增加。tyrosinase activityDendrite-like outgrowthMelanin productionfind out the agent that induce melanoma cell differentiation from plants（圖片來自文獻(xiàn)）中藥木鱉子中藥木鱉子本實驗將探討中藥木鱉子提

5、取物對黑色素瘤本實驗將探討中藥木鱉子提取物對黑色素瘤B16細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及其相細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及其相關(guān)機(jī)制關(guān)機(jī)制主產(chǎn)：廣西、四川、主產(chǎn)：廣西、四川、 湖北。湖北。主治：消腫散結(jié)，祛毒。主治：消腫散結(jié)，祛毒。治癰腫、疔瘡、痔瘡、治癰腫、疔瘡、痔瘡、無名腫毒無名腫毒 。多在治療腫瘤的方劑中出現(xiàn)，多在治療腫瘤的方劑中出現(xiàn)，但是文獻(xiàn)中并未見木鱉子提但是文獻(xiàn)中并未見木鱉子提取物抗腫瘤的研究報道取物抗腫瘤的研究報道。實驗路線和方法：實驗路線和方法：活性成分提取乙醇浸泡7天,加熱回流提取2次 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀冷凍濃縮成浸膏萃取 乙酸乙酯 ( 石油醚 ) 正丁醇 乙醚 水相木鱉子木鱉子MTT法、形態(tài)學(xué)檢測篩選

6、出具有生物活性的液相大孔樹脂硅膠柱層析篩選出活性單體化合物 陽性對照：-MSH B16 cells細(xì)胞增殖抑制和集落形成率 木鱉子活性成分細(xì)胞活性細(xì)胞活性檢測檢測細(xì)胞功能細(xì)胞功能形態(tài)觀察形態(tài)觀察黑色素酪氨酸酶 細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力檢測P38ERKJNK基因水平表達(dá)變化特異性通路抑制劑SB203580(P38）、PD98059(MEK)對藥物誘導(dǎo)分化的影響P38ERKJNK蛋白水平及活性（磷酸化水平）的變化 選擇活性改變顯著的通路檢測該通路下游基因及蛋白表達(dá)的變化MAPKs通路上游PKA、PKC活性的變化Giemsa染色/超微結(jié)構(gòu)觀察/熒光染色（AlexaFluor488 phalloidin)Co

7、mpare with Control, P0.01, *P0.001Table 1 Inhibitory effect of CMSEE on melanoma B16 cells1234 Fig.1 Effect of CMSEE on the clone forming of B16 cellsA: The representative picture of clone forming(200). 1.Control；2.CMSEE (10mg/L)；3.CMSEE (20 mg/L);4.CMSEE(40mg/L) B: Clones counting.Compare with cont

8、rol group, *P0.05,*P0.01ABCMSEE對對B16細(xì)胞增殖活性及克隆形成率的細(xì)胞增殖活性及克隆形成率的影響影響 The cell viability and modality of B16 cells after treatment by CMSEE(200). Morphological changes of B16 cells observed under the microscope. 1: untreated cell; 2: CMSEE (20mg/L); 3: CMSEE (100mg/L) 13x200 x200 x400 Fig.2 Morphologic

9、al changes of B16 cells after treated with CMSEE (20mg/L) for 48h. Untreated cellCMSEE Treated cellCMSEE對對B16細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞形態(tài)的影響細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核大小均一，核漿比例減少，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核大小均一，核漿比例減少，出現(xiàn)典型的樹突狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈梭形排列出現(xiàn)典型的樹突狀和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈梭形排列 CMSEE作用于作用于B16細(xì)胞的透射電鏡形態(tài)變化細(xì)胞的透射電鏡形態(tài)變化 Control（ 4K）CMSE(20mg/L（ 4K）Control（ 20K）CMSE(20mg/L （ 20

10、K）正常細(xì)胞核大，圓形，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少。未見黑色素小體 。高倍鏡下可見細(xì)胞質(zhì)表面可見許多微絨毛，包膜完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少。 經(jīng)過CMSEE處理后，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞核縮小，異染色質(zhì)增多，呈多邊形，細(xì)胞表面微絨毛減少，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，核質(zhì)比減小，可見不同的黑色素小體，部分細(xì)胞大量黑色素小體聚集成團(tuán)。 Fig.2 Morphological changes of B16 cells electron microscopeobserved by electron microscope after treated with CMSEE by (20mg/L) for 48h. 不同濃度

11、不同濃度CMSEE對對B16細(xì)胞分化率的影響細(xì)胞分化率的影響 Figure.3 Enhancing effect of CMSEE on B16 cell differentiation B16 cells were treated for 48h with CMSEE. The cells were assessed by morphologic analysis using Giemsa stain. The arrows indicate differentiated B16 cells with dendrite formation. A: untreated cell;. B, C,

12、 D: treated with CMSEE (10, 20, 40mg/L) ABC020406080100ControlDMSO10mg/L20mg/L40mg/LCMSEE% Differentiation分化率(%)DTable.3 The effect of CMSEE on the production of melanochrome and the activity of tyrosinaseGroupsMelanin/106 cells（A405）Tyrosinase （Folds）Control 0.0370.002DMSO 0.0400.0021.02CMSEE(mg/L)

13、10 0.0570.007*1.390.3220 0.1730.005*2.000.4440 0.2490.002*2.800.52100 0.0200.004*0.570.34Compare with control group, *P0.05, *P0.01 * * *CMSEE對對B16細(xì)胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影響細(xì)胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影響原理：堿裂解法和比色法*CMSEE對對B16細(xì)胞遷徙和轉(zhuǎn)移的影響細(xì)胞遷徙和轉(zhuǎn)移的影響Control5-FuCMSEE(20mg/L)劃痕試驗劃痕試驗侵襲實驗侵襲實驗MAPK信號通路對腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用信號通路對腫瘤細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用

14、絲裂原活化蛋白激酶絲裂原活化蛋白激酶( (MAPK)MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面最活躍的研究領(lǐng)域。研究表近年來信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面最活躍的研究領(lǐng)域。研究表明明, ,它們與腫瘤細(xì)胞的凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移它們與腫瘤細(xì)胞的凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等有著重要關(guān)系等有著重要關(guān)系, , 將為腫瘤的治療提供新的靶點。將為腫瘤的治療提供新的靶點。 ERK ERK是受外界刺激時決定細(xì)胞命運的關(guān)鍵性是受外界刺激時決定細(xì)胞命運的關(guān)鍵性因素因素, ,它能促進(jìn)增殖它能促進(jìn)增殖, ,決定細(xì)胞向終末期分化或發(fā)決定細(xì)胞向終末期分化或發(fā)生凋亡。生凋亡。JNKJNK和和P38P38主要被應(yīng)激刺激和病理性損傷主

15、要被應(yīng)激刺激和病理性損傷信號所激活信號所激活, ,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡反應(yīng), ,但在某些細(xì)胞類但在某些細(xì)胞類型也被有絲分裂原激活型也被有絲分裂原激活, ,介導(dǎo)細(xì)胞分化與增殖。介導(dǎo)細(xì)胞分化與增殖。 研究表明，研究表明，MAPKS通路的活性參與了通路的活性參與了黑色素瘤細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)CMSEE對對B16細(xì)胞細(xì)胞MAPKs通路活性的影響通路活性的影響 Fig.4 The MAPKs activition (P38, JNK, ERK1/2) in CMSEE-induced B16 differentiation 20 20mg/L CMSEEmg/L CMSEE能顯著

16、提高能顯著提高p-P38p-P38和和p-JNKp-JNK的表達(dá)水平的表達(dá)水平( (P0.01)P0.01)，在第在第2 2h h時最明顯。且能降低時最明顯。且能降低p-ERK1/2p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平，在第的蛋白表達(dá)水平，在第4 4h h時最明顯。表明時最明顯。表明CMSEECMSEE對黑色素瘤對黑色素瘤B16B16細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用與細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用與其提高其提高P38P38通路和通路和JNKJNK通路通路和和阻滯阻滯ERK1/2ERK1/2通路的活性相關(guān)。通路的活性相關(guān)。p-p38PD98059對對CMSEE誘導(dǎo)誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化的影響細(xì)胞分化的影響 Control PD C

17、MSEE CMSEE+PD CMSEE PD p-ERK1/2GAPDH(B) Fig.5 The effect of PD98059 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents (A) 經(jīng)經(jīng)4040MM的的ERKERK通路阻滯劑通路阻滯劑PD98059PD98059預(yù)

18、處理預(yù)處理1 1h h后，后，2020mg/Lmg/L的的CMSEECMSEE對對B16B16細(xì)胞的分化作用明顯增強(qiáng)，細(xì)胞的分化作用明顯增強(qiáng)，p-ERK1/2p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，黑色素蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，黑色素B16B16細(xì)胞樹突狀結(jié)構(gòu)明顯，證明了細(xì)胞樹突狀結(jié)構(gòu)明顯，證明了ERK1/2ERK1/2通路活性的降通路活性的降低促進(jìn)了低促進(jìn)了CMSEECMSEE對黑色素瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用對黑色素瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用 。 1 2 3 4SB302580對對CMSEE誘導(dǎo)誘導(dǎo)B16細(xì)胞分化的影響細(xì)胞分化的影響 Control SB 203580 CMSEE CMSEE+SB20

19、3580 CMSEE SB p-p38 GAPDH Fig.6 The effect of SB302580 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents (A)(B) 經(jīng)經(jīng)2020MM的的P38 MAPP38 MAP通路阻滯劑通路阻滯劑SB302580SB302580預(yù)

20、處理預(yù)處理B16B16細(xì)胞細(xì)胞1 1h h后加入后加入2020mg/Lmg/L的的CMSEECMSEE，B16B16細(xì)胞分化形態(tài)細(xì)胞分化形態(tài)部分被阻滯，證明部分被阻滯，證明SB302580SB302580阻滯了阻滯了CMSEECMSEE對對p38p38通路的激活作用，證實通路的激活作用，證實CMSEECMSEE誘導(dǎo)誘導(dǎo)B16B16細(xì)胞分化與細(xì)胞分化與P38 MAPP38 MAP通路活性降低相關(guān)通路活性降低相關(guān) 結(jié)論：結(jié)論： 中藥木鱉子醇提物能顯著抑制惡性黑色素瘤中藥木鱉子醇提物能顯著抑制惡性黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖和集細(xì)胞的增殖和集落形成能力，并呈時間和濃度依賴性。小鼠黑色素瘤落形成能力，并呈時間和濃度依賴性。小鼠黑色素瘤B16B16細(xì)胞經(jīng)較低細(xì)胞經(jīng)較低濃度濃度CMSEECMSEE作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核大小均一，核漿比例減少，出現(xiàn)樹突狀和網(wǎng)