實(shí)驗(yàn)室微生物鑒定常見生化反應(yīng)及應(yīng)用價(jià)值

1、實(shí)驗(yàn)室微生物鑒定常見生化反應(yīng)及應(yīng)用價(jià)值明膠液化試驗(yàn)(1)原理：某些可以產(chǎn)生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養(yǎng)基成為流動(dòng)的液體。(2)方法：將待檢菌接種于明膠培養(yǎng)基中，22培養(yǎng)7d或更長時(shí)間，每天觀察結(jié)果有無凝固。(3)結(jié)果：如無凝固，則表示明膠已被水解，液化試驗(yàn)陽性。如凝固，則繼續(xù)培養(yǎng)。(4)應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌的鑒別，如奇異變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化吲哚試驗(yàn)(靛基質(zhì)試

2、驗(yàn))(1)原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當(dāng)加入吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚。(2)培養(yǎng)基：蛋白胨水培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培養(yǎng)基中，35孵育2448h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：于兩液面接觸處出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性。(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。硫化氫試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結(jié)合形成黑色沉淀物(硫化鐵或硫化鉛沉淀)。(2)培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。(3)方

3、法：將待檢菌穿刺接種于醋酸鉛培養(yǎng)基中，于35孵育24h -48h，觀察有無黑色沉淀出現(xiàn)。(4)結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?5)應(yīng)用：主要用于鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺(tái)、豬霍亂沙門菌等。尿素分解試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性。(2)培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基，于35孵育1824h小時(shí)觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮浴?5)應(yīng)用：主要用于腸桿

4、菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產(chǎn)堿普羅威登菌陰性。苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)(1)原理：測定細(xì)菌是否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。(2)培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基中，35孵育1824h，滴加10%三氯化鐵試劑34滴，自斜面上方流下。(4)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽性。應(yīng)立即觀察結(jié)果，延長反應(yīng)時(shí)間會(huì)引起退色。(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰

5、性。氨基酸脫羧酶試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺的生成使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來。(2)培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸(賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗(yàn)管和1支氨基酸脫羧酶對照管(無氨基酸)，各覆蓋至少0.5cm高度的無菌石蠟油，35孵育14d，每日觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：對照管應(yīng)為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測定管呈紫色則為陽性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現(xiàn)紫色則試驗(yàn)無意義，不能做出判斷。(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。如沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其余沙

6、門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內(nèi)和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。碳源和氮源利用試驗(yàn)是細(xì)菌對單一來源的碳源利用的鑒定試驗(yàn)。在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基中，細(xì)菌只有利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解生成碳酸鈉使培養(yǎng)基變堿性，pH指示劑溴麝香草酚藍(lán)由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。常用的試驗(yàn)方法有枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、丙二酸鹽利用試驗(yàn)。 枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源，而在此培養(yǎng)基上生長，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿性。(2)培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，置35孵育14d，逐日觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：若用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或

7、菌苔，培養(yǎng)基由淡藍(lán)色變藍(lán)色為陽性;不能利用枸櫞酸鹽作為碳源的細(xì)菌，在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基不變色，仍為綠色為陰性。(5)應(yīng)用：用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。在腸桿菌科中埃希菌屬、志賀菌屬、愛德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽性。丙二酸鹽利用試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌能利用丙二酸鹽作為唯一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿(2)培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培養(yǎng)基中，置35孵育2448h，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽性。顏色無變化為陰性。(5)應(yīng)用：腸桿菌科中屬間及種的鑒定?？死撞鷮贋殛栃?，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和

8、哈夫尼亞菌屬中有些菌種也呈陽性，其它各菌屬均為陰性。氧化酶試驗(yàn)(1)原理：氧化酶(即細(xì)胞色素氧化酶)，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。因此，本試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。(2)方法：1)菌落法：直接滴加試劑于被檢菌落上。2)濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，蘸取菌少許，然后加試劑。3)試劑紙片法：將濾紙片浸泡于試劑中制成試劑紙片，取菌涂于試劑紙上。(3)結(jié)果：細(xì)菌在與試劑接觸10秒內(nèi)呈深紫色，為陽性。無色為陰性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。(4)應(yīng)用：主

9、要用于腸桿菌科細(xì)菌和假單胞菌屬的鑒別，前者陰性，而后者陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細(xì)菌也呈陽性反應(yīng)。過氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn)) (1)原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。(2)方法：取潔凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3%過氧化氫數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：若立即出現(xiàn)大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。(4)應(yīng)用：革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗(yàn)常用于革蘭陽性球菌的初步分群。 硝酸鹽還原試驗(yàn)(1)原理：硝酸鹽還原反應(yīng)包括兩個(gè)過程：一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)

10、胞內(nèi)其它含氮化合物;二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細(xì)菌不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等;有的細(xì)菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨;有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如沙雷菌屬;有的細(xì)菌還可以將其還原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。 (2)培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基。(3)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基(內(nèi)含小倒管)中，35孵育14d。將甲、乙等量混合液(用時(shí)混合)(約0.1ml)加于試管內(nèi)，立即觀察結(jié)果。 (4)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。若加入試劑后無顏色反應(yīng)，可能是：硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)

11、陰性;硝酸鹽被還原為氨和氮等其他物質(zhì)而導(dǎo)致假陰性結(jié)果，這時(shí)應(yīng)在試管內(nèi)加入少許鋅粉，如出現(xiàn)紅色則表明試驗(yàn)確實(shí)為陰性。若仍不產(chǎn)生紅色，表明試驗(yàn)為假陰性。若要觀察是否有氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培養(yǎng)基管內(nèi)加1只小導(dǎo)管，有氣泡產(chǎn)生，則表示有氮?dú)馍伞?5)應(yīng)用：本試驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產(chǎn)生氮?dú)?有些厭氧菌如韋榮菌等試驗(yàn)也為陽性。脂酶試驗(yàn)(1)原理：有些細(xì)菌產(chǎn)生脂酶，可分解脂肪成游離的脂肪酸。在培養(yǎng)基中加入維多利亞藍(lán)可與脂肪結(jié)合成為無色化合物，如果脂肪被分解，則維多利亞藍(lán)被釋放出來，呈現(xiàn)深藍(lán)色。(2)培養(yǎng)基：含維多利亞藍(lán)的脂酶培養(yǎng)基

12、。(3)方法：將待檢菌接種于含維多利亞藍(lán)的脂酶培養(yǎng)基中，置37孵育24h，觀察結(jié)果。 (4)結(jié)果：培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性，陰性為無色或粉紅色。(5)應(yīng)用：主要用于厭氧菌鑒定。在類桿菌中的中間類桿菌產(chǎn)生脂酶，其它類桿菌陰性;在芽孢梭菌屬中產(chǎn)芽胞梭菌、肉毒梭菌和諾維梭菌也產(chǎn)生此酶，而其它梭菌為陰性。卵磷脂酶試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌產(chǎn)生卵磷脂酶(-毒素)，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵磷脂，形成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。(2)培養(yǎng)基：1%卵黃瓊脂平板。(3)方法：取待檢菌劃線接種或點(diǎn)種在卵黃瓊脂平板上，置35孵育36h，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：3h后在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán)，即為卵

13、磷脂酶試驗(yàn)陽性，6h后該混濁圈可擴(kuò)大到直徑56mm。 (5)應(yīng)用：該試驗(yàn)主要用于厭氧菌的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽性，其他梭菌為陰性。蠟樣芽孢桿菌亦為陽性。 凝固酶試驗(yàn)(1)原理：凝固酶試驗(yàn)是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗(yàn)。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使其變?yōu)槔w維蛋白，發(fā)生凝集，包圍于細(xì)菌外面而凝聚成塊，可用玻片法測出;另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產(chǎn)物，使纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固，可用試管法測出。 (2)方法：玻片法：取兔血漿和鹽水各一滴

14、，分別置于潔凈的玻片中央，用接種環(huán)取待檢菌分別與血漿和鹽水混合。試管法：取試管2支，各加0.5ml人或兔血漿，挑取被檢菌和陽性對照菌分別加入血漿中并均勻，置37水浴3-4小時(shí)，每30min觀察1次結(jié)果。(3)結(jié)果：玻片法：以血漿中有明顯的顆粒出現(xiàn)而鹽水中無自凝現(xiàn)象為陽性。試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。2h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察。(4)應(yīng)用：凝固酶試驗(yàn)是鑒定葡萄球菌致病性的重要試驗(yàn)，也是葡萄球鑒別時(shí)常用的試驗(yàn)。CAMP試驗(yàn)(1)原理：B群鏈球菌(無乳鏈球菌)產(chǎn)生一種“CAMP”因子，可促進(jìn)葡萄球菌的-溶血素溶解紅細(xì)胞的活性。因此，可在兩種細(xì)菌(B群鏈球菌和葡萄球菌)的交界處

15、溶血力增強(qiáng)，出現(xiàn)半月型透明溶血區(qū)。(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板。(3)方法：在羊血或馬血瓊脂平板上，先以產(chǎn)-溶血素的金黃色葡萄球菌劃一橫線接種。再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者不能相交，應(yīng)相距0.5-1cm，于35孵育1824h，觀察結(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)做陰陽性對照。(4)結(jié)果：兩種細(xì)菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽性。(5)應(yīng)用：在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽性，故可作為特異性鑒定。其他鏈球菌均為陰性。膽汁溶菌試驗(yàn)(1)原理：膽汁或去氧膽酸鈉能導(dǎo)致某些細(xì)菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細(xì)菌細(xì)胞膜上的表面張力，使細(xì)菌的細(xì)胞膜破損或使菌體裂解。另一方面可能是由于膽汁激活細(xì)菌體內(nèi)的

16、自溶酶，加速了細(xì)菌的自溶。(2)方法：試管法：用純培養(yǎng)物制備1.8ml生理鹽水濃菌懸液，pH調(diào)至7.0，分裝兩支試管，各0.9ml。其中一管加10%去氧膽酸鈉為試驗(yàn)管，另一管加0.5ml生理鹽水作對照。35孵育10-30分鐘，觀察結(jié)果。平板法：在血平板上選取單個(gè)可疑菌落，作好標(biāo)記，直接在菌落上加1接種環(huán)10%去氧膽酸鈉(pH7.0)，置35孵育30min(平板不要翻轉(zhuǎn))觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：試管法：以“加膽鹽的培養(yǎng)物透明，而對照管仍混濁”為陽性。平板法：如菌落消失，僅留下溶血區(qū)為陽性，菌落不消失為陰性。(4)應(yīng)用：主要用于肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的鑒定，前者衛(wèi)陽性，后者為陰性。O/129抑菌試驗(yàn)

17、(1)原理：O/129(二氨基喋啶)對弧菌屬細(xì)菌有抑制作用，而對氣單胞菌屬無抑制作用。(2)堿性瓊脂平板。(3)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于堿性瓊脂平板上，將O/129診斷紙片(含藥40g/片)貼于平板上，置35孵育1824h，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：出現(xiàn)抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)者為耐藥。(5)應(yīng)用：主要用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌為敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。桿菌肽試驗(yàn)(4)結(jié)果：抑菌環(huán)直徑大于10mm為敏感，抑菌環(huán)直徑小于10mm為耐藥。 (5)應(yīng)用：主要用于A群鏈球菌與非A群鏈球菌的鑒別。 DNA酶試驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA水解成為

18、寡核苷酸鏈。因?yàn)殚L鏈DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸則溶于酸。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在菌落周圍形成透明環(huán)。(2)培養(yǎng)基：0.2%DNA瓊脂平板。(3)方法：在DNA瓊脂平板上點(diǎn)種待檢菌，35孵育1824h，用1mol/L鹽酸傾注平板，觀察結(jié)果。(4)結(jié)果：如菌落周圍有透明環(huán)者為陽性，無透明環(huán)為陰性。(5)應(yīng)用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。在G+球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷菌、變形桿菌產(chǎn)生DNA酶，均為陽性。奧普托欣(Optochin)試驗(yàn)(1)原理：Optochin(奧普托欣)是鹽酸乙基氫化羥基奎寧的商品名。對肺炎鏈球菌有特異抑制作用，幾乎所有肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其作用機(jī)制可能是干擾葉酸生物合成作用，而對其它鏈球菌則無此作用。(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板。 (3)方法：用棉拭子將待