常規(guī)細胞培養(yǎng)方法

1、常規(guī)細胞培養(yǎng)方法（原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)）初代培養(yǎng)原理將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白 酶）、螯合劑（常用EDTA ）或機械方法處理，分散成單細胞，置合 適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代 培養(yǎng)。儀器、材料及試劑儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37 °C）,培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、 平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴 箱（37 C）材料：動物組織塊試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，HankS 液，碘酒初代消化培養(yǎng)法1準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、7

2、5%酒精擦拭手至肘部。2布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用 Hanks液漂洗23次， 去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中 3060分鐘。4. 剪切：用眼科剪把組織切成23毫米大小的塊，以便于消化。 加入比組織塊總量多3050倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒 瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞。5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37 C溫箱消化均可，消化中每隔 20分鐘應(yīng)搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組 織塊的大小和組織的硬度而定。6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或

3、單個細胞，立即終止消化， 隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（5001000轉(zhuǎn)/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的 培養(yǎng)液。7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說， pH要求在7.27. 4圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用 NaHCO 3調(diào)整。8. 培養(yǎng)：置于36.5 C溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用 紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。初代組織塊培養(yǎng)法1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜

4、Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切1m m3塊為止。2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭 把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一 2 5ml培養(yǎng)瓶底可擺布2030塊。3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動， 塞好瓶塞，置36.5 C溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小 塊微干涸。4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底 腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。 置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織 塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。傳代培養(yǎng)法原理細胞在培養(yǎng)瓶長成

5、致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù) 生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行 各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng) 消化后才能分瓶。材料和試劑1. 細胞：貼壁細胞株2試劑：0.25 %胰酶、1640培養(yǎng)基（含10 %小牛血清）3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等操作步驟1. 吸除培養(yǎng)瓶舊培養(yǎng)液。2. 向瓶加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。3置溫箱中25分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，立 即終止消化。4. 吸除消化液，向瓶注入Hanks液數(shù)

6、毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，把 殘余消化液沖掉。注意加 Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把 已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液 后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形 成細胞懸液。6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置 溫箱中培養(yǎng)。無菌操作注意事項1操作前要洗手，進入超凈臺后手要用 75%酒精或0.2%新潔爾 滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上 燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組 織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3