藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法ADMET方法課件

1、藥學(xué)中的生物技術(shù)和方法ADMET方法什么是ADMET Absorption 吸收 Distribution 分布 Metabolism 代謝 Excretion 排出 Toxicity 毒性 ADME是藥物動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetics, PK)的內(nèi)容藥物研發(fā)的并行策略合成化合物或分離天然產(chǎn)物 生物活性 生物選擇性 物理化學(xué)性質(zhì) 藥物吸收 藥物代謝 大分子結(jié)合 細(xì)胞毒性 優(yōu)化的優(yōu)化的先導(dǎo)化合物先導(dǎo)化合物候選藥物現(xiàn)代ADMET研究方法的特點(diǎn) 基于細(xì)胞或生物大分子的分析方法 人源材料的應(yīng)用 小樣品、高內(nèi)涵和高通量分析能力 能夠闡明藥物性質(zhì)的分子機(jī)理、建立結(jié)構(gòu)-藥物性質(zhì)定量構(gòu)效關(guān)系合理藥物

2、運(yùn)輸/制劑系統(tǒng) 以往的研究表明：藥物運(yùn)輸系統(tǒng)只能輔助而不能根本性的改變藥物的口服吸收能力 合理的藥物運(yùn)輸/制劑系統(tǒng)(rational drug delivery)必須依據(jù)藥物本身的穿越消化腸道屏障的滲透能力BCS系統(tǒng)FDA制定了BCS的評(píng)價(jià)指南。BCS的評(píng)價(jià)主要包括下列三個(gè)方面： 藥物的生物滲透能力（藥物的生物滲透能力（permeability） 藥物的溶解能力（藥物的溶解能力（Solubility） 制劑的快速溶出能力（制劑的快速溶出能力（Immediate Release）上述性質(zhì)符合要求的藥物/制劑可以在藥審時(shí)得到生物豁免。藥物吸收吸收屏障結(jié)構(gòu)底側(cè)（Basolateral）頂側(cè)（Apic

3、al） 經(jīng)細(xì)胞連接的被動(dòng)擴(kuò)散Paracellular diffusion穿細(xì)胞穿細(xì)胞被動(dòng)擴(kuò)散被動(dòng)擴(kuò)散Transcellular diffusion代謝轉(zhuǎn)化A B外流外流Efflux藥物轉(zhuǎn)運(yùn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)transportACD藥物消化道吸收的基本機(jī)制體外單層腸上皮細(xì)胞藥物吸收模型腸上皮細(xì)胞/細(xì)胞系組織/細(xì)胞培養(yǎng)多空膜基底吸收細(xì)胞單層Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板已被認(rèn)證的用于藥物吸收的細(xì)胞系 Caco-2 人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 具有分化的腸上皮細(xì)胞特征和重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝酶 MDCK 狗腎上皮細(xì)胞系Caco-2藥物吸收模型的創(chuàng)建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究團(tuán)隊(duì)Caco-2模型的制備

4、過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)Transwell接種細(xì)胞匯合細(xì)胞分化完備細(xì)胞收集2-3天2-3天23星期藥物吸收測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果-滲透能力 吸收較好的藥物： Papp 210-6 Testosterone：1.010-5 cm/s Propranolol: 2.8610-5cm/s 吸收差藥物： Papp 10-6 Mannitol：1.010-7 cm/s Atenolol: Papp= 4.5510-7 cm/sBrain Blood Barrier（BBB）BBB結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用 星形膠質(zhì)細(xì)胞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞緊密連接誘導(dǎo)一些酶和分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞星形膠質(zhì)細(xì)

5、胞趨化現(xiàn)象表型的調(diào)節(jié)BBB滲透機(jī)理influxefflux緊密連接（tight junction）的結(jié)構(gòu)AP端：血液BL端：腦實(shí)質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜多孔聚碳酯膜藥物排出藥物清除藥物清除 = 代謝代謝 + 排出排出腎排出：超濾機(jī)制游離小分子藥物及其代謝物腎小球腎小管藥物重吸收大分子化合物大分子結(jié)合藥物腎排出因素：PPB 和 Papp0.30.40.50.60.70.80.91.01.10.00.20.40.60.81.0atenololethosuximideguanethidinemeprobamateparaceutamolpromidoneUrine

6、 excrection factorAbsorption fraction(Absorption fraction 0.9)(PPB0.05)0204060801000.00.20.40.60.81.0warfarinrifampincinminocyclinedapsonechloramphenicolpyrrocloxycyclinesulfadiazineamoxicilincefaloglycincindamycincolfibrateprocainamideUrine excreation ratePPB膽汁分泌和腸肝循環(huán)MetabolismEnterohepatic circula

7、tionpravastatinADPATPSmall IntestineAbsorptionHepatic uptakeBiliary excretioncMOAToatpLiverBinding to HMG-CoA reductaseDrugBinding to cytoplasmic proteins肝臟處置藥物的基本途徑膽汁NTCPOATPsOAT2OATP2MRPsMDR1BCRPBSEP/SPGP腸道藥物藥物代謝物Basal（blood）Apical（bile）OATP2MDCKII(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277

8、(8), 6497-6593 (2002) 藥物經(jīng)膽汁排出的細(xì)胞模型- OATP2/MRP2 雙轉(zhuǎn)染 MDCK細(xì)胞單層MRP2/cMOAT藥物的肝臟代謝藥物代謝的基本過(guò)程藥物R氧化產(chǎn)物R-OH結(jié)合產(chǎn)物R-O-X排出物I相代謝II相代謝II+相代謝：藥物外流II相代謝水解產(chǎn)物X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione I相代謝關(guān)鍵酶-細(xì)胞色素P450 細(xì)胞色素P450 (CYP)家族 CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 NADPH依賴的氧化酶 CYP3A4

9、 是藥物的主要代謝酶 50%已知藥物通過(guò)CYP3A4代謝II 相代謝關(guān)鍵酶 UDP-依賴葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT) 苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶 (PST) 雌激素磺基轉(zhuǎn)移酶 (EST) 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST) 一些細(xì)胞抗氧化酶 三種肝細(xì)胞制品及代謝分析全肝細(xì)胞代謝分析全肝細(xì)胞代謝分析肝微粒體代謝分析肝微粒體代謝分析S-9肝勻漿液肝勻漿液代謝分析代謝分析藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析過(guò)程藥物肝臟代謝穩(wěn)定性分析結(jié)果% 原藥消失率 = （1 - ）100%原始藥物濃度c0代謝反應(yīng)后藥物濃度ct全肝細(xì)胞全肝細(xì)胞()肝微粒體肝微粒體() 僅包括I相代謝酶 易于保存 分析操作容易、費(fèi)用低 包括所有代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

10、費(fèi)用高，細(xì)胞保存不易S9肝勻漿液肝勻漿液() 包括主要I、II相代謝酶 分析操作容易、費(fèi)用低 勻漿液保存不穩(wěn)定藥物毒性藥物毒性評(píng)價(jià)的基本方式-細(xì)胞活力分析 細(xì)胞生長(zhǎng) 細(xì)胞能荷 線粒體活性線粒體活性-MTT分析分析 細(xì)胞氧化還原狀態(tài)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)-谷胱甘肽含量分析谷胱甘肽含量分析 細(xì)胞特征性功能 蛋白質(zhì)合成 核酸合成 吞噬、排除外來(lái)分子能力等 細(xì)胞膜完整性細(xì)胞膜完整性-胞漿酶活性分析胞漿酶活性分析MTT細(xì)胞活力分析 原理： 線粒體酶將探針?lè)肿覯TT*還原成為一種藍(lán)色脂溶性染料formazan（吸收波長(zhǎng)550nm） 線粒體活性越高，轉(zhuǎn)化能力越強(qiáng) 實(shí)驗(yàn)方法：將MTT加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，反應(yīng)一段時(shí)間

11、后，用有機(jī)溶劑溶解產(chǎn)生的formazan，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定 550 nm吸光度. 特點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單可靠，費(fèi)用低，高通量* MTT：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide藥物毒性分析過(guò)程LD50，IC50，EC50線粒體毒性模型 Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological Development World Pharmaceutical Congress, June, 2010 ROSATP synthesisCyt cDjm關(guān)于藥物毒性分析數(shù)據(jù)

12、 毒性分析的結(jié)果是LD50或IC50或EC50，表示藥物導(dǎo)致細(xì)胞活力降低一半時(shí)需要的濃度 LD50或IC50或EC50越小，藥物毒性越大 每種細(xì)胞活力分析方法都具有片面性，多種方法測(cè)定一種化合物毒性是有益的 進(jìn)行藥物毒性分析時(shí)，推薦使用人源的原代完整肝細(xì)胞，數(shù)據(jù)可靠性高 當(dāng)使用永生化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞時(shí)，由于這些細(xì)胞(特別是腫瘤細(xì)胞)的藥物代謝能力較差，因此得到的細(xì)胞毒性數(shù)據(jù)是一種“本征毒性(intrinsic toxicity)”。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推廣應(yīng)用時(shí)，注意補(bǔ)償不同組織細(xì)胞的代謝能力。藥物毒性和藥物-藥物相互作用 排出抑制型相互作用： 藥物1抑制藥物2的排出，導(dǎo)致藥物2濃度過(guò)高產(chǎn)生毒性 代謝抑制

13、型相互作用 藥物1抑制藥物2的代謝，導(dǎo)致藥物2濃度過(guò)高產(chǎn)生毒性 代謝誘導(dǎo)型相互作用 藥物2誘導(dǎo)藥物2的代謝，導(dǎo)致 藥物2被過(guò)度活化，使代謝毒性產(chǎn)物濃度增加 藥物2因代謝失效小結(jié)：ADMET研究諸方面ADME：生物利用率藥物間相互作用藥物分布血漿蛋白結(jié)合力血腦屏障滲透能力藥物清除藥物吸收消化道穩(wěn)定性腎排出肝臟清除代謝穩(wěn)定性膽汁排出溶解性滲透能力代謝誘導(dǎo)代謝抑制藥物毒性T細(xì)胞活力抑制分析排出抑制擴(kuò)散能力藥物外流載體藥物吸收載體代謝酶亞型一個(gè)例子- 食物中的黃酮類化合物食物成分黃酮類化合物及其作用 雌激素樣作用 弱類雌激素活性 防治一些和激素水平下降有關(guān)的疾病，如衰老、更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松、血脂升

14、高等 抗雌激素活性 預(yù)防激素依賴型腫瘤及心血管疾病的發(fā)生。 抗氧化作用 抑制腫瘤作用 降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂，預(yù)防心血管疾病和老年性癡呆癥 OOR5R7A (1-25)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7B (26-29)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7C (30-34)R8R6R2R4R3R5OOR5R7A (1-25)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7B (26-29)R3R2R3R8R6R5R4OOR5R7C (30-34)R8R6R2R4R3R5黃酮通式異黃酮通式黃酮苷和黃酮苷元大豆異黃酮苷元大豆異黃酮葡萄糖甙水解b-葡萄糖苷酶（腸道微生物）腸道乳糖-根皮素水解酶O黃酮類化合物的吸收代謝機(jī)制黃酮苷黃酮苷元水解CYPs 代謝分解MRP2BCRPUGTSulT緊密連接MRP3酶水解酶水解肝、腎排出肝、腎排出黃酮類化合物吸收的關(guān)鍵因素 黃酮苷的水解-利于吸收因素 腸道正常細(xì)菌群 黃酮苷元的代謝穩(wěn)定性-不利于吸收因素 II相代謝和II+向外排出 I相氧化分解 解決方法： 混合黃酮制劑 苷元羥基甲基化思考題 什么是ADMET研究，在藥物發(fā)現(xiàn)中的作用是什么？ 現(xiàn)代ADMET方法有什么特點(diǎn)？ 什么是BCS？ 藥物消化道吸收的分子