細(xì)胞原代培養(yǎng) 細(xì)胞生物學(xué)實驗報告

1、細(xì)胞生物學(xué)實驗報告細(xì)胞原代培養(yǎng) 姓名： 學(xué)號： 班級： 專業(yè)： 同組成員： 一、實驗原理 細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進(jìn)行培養(yǎng)。由于培養(yǎng)的細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段。同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。 原代培養(yǎng)的方法： 1、組織塊法 在平皿中用彎頭剪把組織盡量剪碎，每個組織塊小于1mm3大小。用Hanks液洗滌23次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。將組織塊貼于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。 2、酶消化法 將1mm3大小的組織塊放入1個

2、三角瓶內(nèi)加入1030ml的0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒攪拌消化2030分鐘。然后終止消化。用幾層無菌紗布過濾。取過濾液，離心800rpm 510分鐘收集細(xì)胞。棄上清，加入帶有雙抗的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 。 取材注意事項： 取材要注意新鮮和保鮮。取材應(yīng)嚴(yán)格無菌。取材和原代細(xì)胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。要仔細(xì)去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。 取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易

3、生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。 二、實驗?zāi)康?、理解細(xì)胞原代培養(yǎng)原理2、熟悉細(xì)胞原代培養(yǎng)方法與過程3、了解細(xì)胞原代培養(yǎng)的應(yīng)用4、獨立進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)操作三、實驗材料手術(shù)小直剪刀、眼科直鑷子、眼科彎鑷子、玻璃平皿、培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴斯德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈。動物：9-12日齡的雞胚蛋四、實驗步驟1、購買9-12日齡雞胚蛋。放入孵化箱中孵養(yǎng)待用。2、取雞胚蛋一枚放入超凈工作臺中，用酒精棉球擦拭雞蛋殼后，氣室處擦拭兩遍，用鑷子小心去除氣室部分的蛋殼。3、取D-hanks液按1:100加入雙抗。4、換用潔凈的無菌鑷子揭開膜，再用潔凈的無菌彎頭鑷子取出雞胚至滅菌的培養(yǎng)皿中，并用

4、D-hanks液沖洗雞胚三遍。5、用眼科剪去除雞胚的頭部、四肢以及內(nèi)臟，然后用D-hanks液充分洗滌軀干部分三遍。6、將洗滌過的軀干移至干凈的培養(yǎng)皿，吸去多余的液體，然后用眼科剪將軀干充分剪碎（約四分之一米粒大?。?。7、向碎塊中加入一滴管胎牛血清將組織碎塊切散，用滴管將組織碎塊接入培養(yǎng)瓶中，靜置一分鐘，再加入5ml完全培養(yǎng)液，將瓶子翻轉(zhuǎn)倒置后在37度培養(yǎng)箱中放置2-3小時，待組織塊微干與瓶壁貼牢后再將瓶子翻轉(zhuǎn)過來，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8、將用過的試劑儀器等擺回原處，將超凈臺打掃干凈，關(guān)閉照明燈及抽風(fēng)機(jī)。9、實驗后數(shù)小時后去觀察組織塊中細(xì)胞遷移情況，并拍攝照片。五、實驗結(jié)果 原代培養(yǎng)過夜后第二天中

5、午一點拍照，觀察細(xì)胞遷移情況，以下是我們小組的實驗結(jié)果。 雞胚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)（倒置顯微鏡20×） 雞胚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)（倒置顯微鏡20×）顯微鏡下可觀察到雞胚組織塊附近有大量細(xì)胞遷移。遷移出來的細(xì)胞呈纖維狀，貼壁生長。實驗結(jié)果比較理想，細(xì)胞遷移較多，大部分細(xì)胞活性較好，呈梭形附著與瓶壁上，且沒有污染發(fā)生。操作時應(yīng)注意的問題：原代培養(yǎng)要注意無菌操作，實驗過程中要保持組織塊浸潤在緩沖液中，接種組織塊到培養(yǎng)瓶中后應(yīng)待組織略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有粘壁，則細(xì)胞不易生長，既使生長也因沒有貼在瓶壁上，而無法收集到

6、。六、思考題1、從細(xì)胞增殖及調(diào)控角度來看哪種組織和器官適用于原代培養(yǎng)實驗？取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。2、如何提高原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率？ 取材要注意新鮮和保鮮，取材應(yīng)嚴(yán)格無菌。取材和原代細(xì)胞制作時，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。 要仔細(xì)去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來講，胚胎組織較成熟個體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的

7、組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。 操作過程要時刻注意無菌操作，不能污染，儀器盡量靠無菌操作臺內(nèi)放。在處理胚胎的時候要干凈利落。在剪碎細(xì)胞的時候，盡量剪得碎一點。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶應(yīng)待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉(zhuǎn)時要輕，勿使組織塊漂浮起來。3、雞胚成纖維細(xì)胞的應(yīng)用？雞胚成纖維細(xì)胞具有相對容易獲得、增殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、良好的耐受性，性狀比較穩(wěn)定等特點，使得其廣泛的被應(yīng)用于分子和細(xì)胞生物學(xué)研究的許多方面。雞胚成纖維細(xì)胞良好的耐受性使之易于進(jìn)行從基因轉(zhuǎn)染到微注射等較多領(lǐng)域的研究,還被廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究,同時也是疫苗生產(chǎn)的一種重要的細(xì)胞資源。現(xiàn)在它被用來生產(chǎn)各種雞的疫苗,如傳染性法氏囊病、馬立克病、新城疫疫苗等,也被用來表達(dá)一些基因工程產(chǎn)物。雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)在分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及細(xì)胞工程學(xué)等領(lǐng)