ELISA檢測(cè)技術(shù)最新版本

1、整理整理ppt1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)ELISA技術(shù)簡(jiǎn)介技術(shù)簡(jiǎn)介ELISA的基本原理的基本原理ELISA的類型和方法的類型和方法ELISA方法注意事項(xiàng)和應(yīng)用方法注意事項(xiàng)和應(yīng)用整理整理ppt2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ： 基于抗原基于抗原-抗體反應(yīng)的抗體反應(yīng)的特異性特異性和和等比例性等比例性，是酶免疫測(cè)定技，是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附（

2、包被包被）在固相載體）在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標(biāo)板聚苯乙烯微量反應(yīng)板，也稱酶標(biāo)板 ) 表表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生相中的游離成分洗除，加入相應(yīng)的酶底物后發(fā)生顏色反應(yīng)顏色反應(yīng)，通，通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，通過(guò)顏色反應(yīng)過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，通過(guò)顏色反應(yīng)的深淺檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測(cè)技術(shù)的深淺檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原含量的檢測(cè)技術(shù) 。 ELISA的發(fā)展概況的發(fā)展概況 自從自從Engvall和和Perlman（

3、瑞典，（瑞典，1971）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以來(lái)，由于）以來(lái)，由于ELISA技術(shù)具有快速、敏感、技術(shù)具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用 。 隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，將利用基因工程技術(shù)制備的抗原或單克隆抗體包被酶標(biāo)板后，極大地提高了或單克隆抗體包被酶標(biāo)板后，極大地提高了ELISA檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)的特異性，加之電腦化程度極高的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用，使檢測(cè)儀的使用，使ELISA更

4、為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢更為簡(jiǎn)便實(shí)用和標(biāo)準(zhǔn)化，從而使其成為最廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法之一。測(cè)方法之一。 目前，目前，ELISA檢測(cè)技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗(yàn)檢疫、檢測(cè)技術(shù)在科學(xué)研究、疾病診斷、檢驗(yàn)檢疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。ELISA的基本原理的基本原理 酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶與吸附在固相載體上

5、的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)顏色反應(yīng)。因此，。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定，。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合

6、起來(lái)，使使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。 基本原理基本原理整理整理ppt5ELISA試劑盒的組成試劑盒的組成完整的完整的ELISA試劑盒通常包含以下各組分：試劑盒通常包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（俗稱）已包被抗原或抗體的固相載體（俗稱酶標(biāo)板酶標(biāo)板）；）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物）；）；（3）酶的）酶的底物底物；（4）參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量試劑盒）及其稀釋液；）參考標(biāo)準(zhǔn)品（定量試劑盒）及其稀釋液；（5）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；）酶標(biāo)記物及樣本的稀釋液；（6）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀

7、釋）；）洗滌液（通常為濃縮液，用前按比例稀釋）；（7）反應(yīng)終止液；）反應(yīng)終止液；（8）封口膜若干、說(shuō)明書一份。）封口膜若干、說(shuō)明書一份。酶標(biāo)板酶標(biāo)板ELISA常用酶類常用酶類辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)DH2+ H2O2 D + H2O上式中，上式中，DH2為供氫體，為供氫體，H2O2為受氫體。為受氫體。常用底物常用底物： 1. 鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)，產(chǎn)物為，產(chǎn)物為橙紅色橙紅色（492nm檢測(cè)檢測(cè)）；）； 2. 四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，產(chǎn)物為，產(chǎn)物為藍(lán)色藍(lán)色，酸性條件下變?yōu)椋嵝詶l件下變?yōu)?黃色黃色（450nm檢測(cè)檢測(cè)

8、）。）。反應(yīng)終止液：反應(yīng)終止液：HCl或或H2SO4溶液。溶液。堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)常用底物常用底物： 1. 對(duì)硝基苯磷酸酯對(duì)硝基苯磷酸酯 ( p-NPP )，產(chǎn)物為，產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚黃色的對(duì)硝基酚 （405nm檢測(cè)）；檢測(cè)）； 2. 發(fā)熒光底物（磷酸發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于熒光測(cè)定，甲基傘酮），可用于熒光測(cè)定，靈敏度高于顯色底物的方法。靈敏度高于顯色底物的方法。反應(yīng)終止液：反應(yīng)終止液：NaOH 溶液。溶液。ELISA所需儀器設(shè)備所需儀器設(shè)備恒溫箱恒溫箱洗板機(jī)洗板機(jī)酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀ELISA的類型和方法的類型和方法半定量半定量E

9、LISA試驗(yàn)試驗(yàn)定量定量ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康脑囼?yàn)?zāi)康脑囼?yàn)性質(zhì)試驗(yàn)性質(zhì)間接法間接法雙抗夾心法雙抗夾心法 (直接夾心法直接夾心法)BAS-ELISA雙夾心法雙夾心法 (間接夾心法間接夾心法)競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA直接法直接法整理整理ppt11 直接法直接法ELISA是將酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上是將酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原-抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量（見(jiàn)后圖）（見(jiàn)后圖） 。該方法可用于檢

10、測(cè)抗體或抗原。該方法可用于檢測(cè)抗體或抗原。 直接法直接法ELISA優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 1. 特異性高、準(zhǔn)確性好；特異性高、準(zhǔn)確性好； 2. 實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短。缺點(diǎn)缺點(diǎn): 1. 應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。應(yīng)用范圍較小，生產(chǎn)難度大。 需制備各種酶標(biāo)抗原或抗體。需制備各種酶標(biāo)抗原或抗體。整理整理ppt12間接法間接法ELISA 間接法間接法ELISA是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被是將酶標(biāo)記在二抗上，當(dāng)抗體（一抗）和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成抗原在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和抗體復(fù)合物后，再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接

11、）反映一抗復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以（間接）反映一抗和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（見(jiàn)后圖）。和抗原的結(jié)合情況，進(jìn)而計(jì)算出抗原或抗體的量（見(jiàn)后圖）。 該方法可用于抗體檢測(cè)該方法可用于抗體檢測(cè)，是目前檢測(cè)抗體最常用的是目前檢測(cè)抗體最常用的ELISA方方法。法。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 1. 適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體; 2. 制備方便，價(jià)格便宜。制備方便，價(jià)格便宜。整理整理ppt13雙抗夾心法雙抗夾心法ELISA 雙抗夾心法雙抗夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原

12、反應(yīng)形成抗體抗原，在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量，物，加入酶反應(yīng)底物，測(cè)定產(chǎn)物的吸光值，計(jì)算出捕獲的抗原量，本方法也稱為本方法也稱為直接夾心法直接夾心法（見(jiàn)后圖）（見(jiàn)后圖） 。 該方法可用于抗原檢測(cè)，該方法可用于抗原檢測(cè)，例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒等，菌、病毒等，是目前檢測(cè)抗原最常用的是目前檢測(cè)抗原最常用的ELISA方法。方法。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 1. 適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。適用范圍廣，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。 2. 制備方便，價(jià)格便宜。制備方便，價(jià)格便

13、宜。整理整理ppt14雙夾心法雙夾心法ELISA 雙夾心法雙夾心法是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用未標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體原，然后用未標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原抗原-未標(biāo)記抗體未標(biāo)記抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體復(fù)合物；再應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原抗原-未標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，未標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體形成抗體-抗原抗原-未標(biāo)記抗體未標(biāo)記抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，也稱為酶標(biāo)二抗復(fù)合物，也稱為間接夾心法間接夾心法（見(jiàn)后圖）。（見(jiàn)后圖）。 該方法可用于抗原檢測(cè)，例如蛋白質(zhì)、病原體等。該方法可用于抗原檢測(cè)，例如蛋白質(zhì)、病原

14、體等。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 1. 靈敏度高。靈敏度高。 2. 制備方便，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。制備方便，無(wú)需制備特殊的酶標(biāo)抗體。缺點(diǎn)缺點(diǎn): 實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜。整理整理ppt16BAS-ELISA BAS-ELISA即生物素即生物素-親和素系統(tǒng)（親和素系統(tǒng)（biotin avidin system, BAS）ELISA法：法：是先將抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，是先將抗體包被在酶標(biāo)板上，用于捕獲抗原，然后用生物素（然后用生物素（biotin）標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體）標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原抗原-生生物素標(biāo)記抗體復(fù)合物，再依次加入親和素、酶標(biāo)記生物素（或直物素標(biāo)記抗體復(fù)合

15、物，再依次加入親和素、酶標(biāo)記生物素（或直接加入酶標(biāo)記的親和素），最后加底物顯色。接加入酶標(biāo)記的親和素），最后加底物顯色。 生物素生物素是一種生長(zhǎng)因子，廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)，又稱輔是一種生長(zhǎng)因子，廣泛分布于動(dòng)、植物體內(nèi)，又稱輔酶酶R或維生素或維生素H。親和素由四個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素具有高度親和素由四個(gè)亞單位組成，對(duì)生物素具有高度親和力，即一個(gè)親和素可以結(jié)合親和力，即一個(gè)親和素可以結(jié)合4個(gè)生物素分子個(gè)生物素分子。因此，。因此，本方法本方法具有信號(hào)放大功能（特點(diǎn)）具有信號(hào)放大功能（特點(diǎn)）。 該方法可用于抗原、抗體以及該方法可用于抗原、抗體以及DNA和和RNA（生物素）檢測(cè)。（生物素）檢測(cè)。整理整

16、理ppt17BAS-ELISA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理整理整理ppt18競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的實(shí)驗(yàn)原理的實(shí)驗(yàn)原理：將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分：將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在為測(cè)定孔和對(duì)照孔，在對(duì)照孔中加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)照孔中加入已知濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原）和酶標(biāo)記物（酶標(biāo)抗原）；在；在測(cè)定孔中同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待檢測(cè)定孔中同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待檢樣本（抗原），樣本（抗原），酶標(biāo)抗原和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形酶標(biāo)抗原和樣品互相競(jìng)爭(zhēng)包被抗體的結(jié)合點(diǎn)，形成酶標(biāo)記的抗原成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)抗抗體

17、復(fù)合物固定在微孔內(nèi)，沒(méi)有吸附的酶標(biāo)抗原通過(guò)洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色原通過(guò)洗滌去除，加入底物后，復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)抗產(chǎn)物。當(dāng)測(cè)定孔內(nèi)的樣本不含抗原時(shí)，固相上的抗體將和酶標(biāo)抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原結(jié)合，加入底物后顯色較深；當(dāng)樣本含有抗原時(shí)，樣本中的抗原和酶標(biāo)抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)抗原結(jié)合的比例越原和酶標(biāo)抗原共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)。酶標(biāo)抗原結(jié)合的比例越高，說(shuō)明結(jié)合在固相抗體上的待測(cè)抗原就越少，反之亦然；在一高，說(shuō)明結(jié)合在固相抗體上的待測(cè)抗原就越少，反之亦然；在一定的

18、條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分定的條件下，復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而計(jì)算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量，從而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。而進(jìn)一步得知樣本中抗原的多少。測(cè)定孔測(cè)定孔EEEEE酶標(biāo)記物底物溶液對(duì)照孔對(duì)照孔EEEEEEEEEEEEEEE酶標(biāo)記物底物溶液參考液(不含抗原)EE樣本(含抗原)競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法ELISA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理整理整理ppt20半定量半定量ELISA試驗(yàn)試驗(yàn)間接法檢測(cè)血清間接法檢測(cè)血清HBsAb含量含量設(shè)計(jì)加板次序設(shè)計(jì)加板次序(空孔、陰、陽(yáng)空孔、陰、陽(yáng))加板

19、加板(陰、陽(yáng)、樣陰、陽(yáng)、樣)37, 30min加酶標(biāo)抗體加酶標(biāo)抗體(空孔除外空孔除外)洗滌洗滌3次，拍干次，拍干加底物溶液加底物溶液(空孔除外空孔除外)37, 10-30min加終止液加終止液(空孔除外空孔除外)避光避光上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果判定上機(jī)檢測(cè)、結(jié)果判定(空孔調(diào)零空孔調(diào)零)37, 30min洗滌洗滌3次，拍干次，拍干雙抗夾心法檢測(cè)血清雙抗夾心法檢測(cè)血清IL-2含量含量設(shè)計(jì)加板次序設(shè)計(jì)加板次序(空孔、陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn)空孔、陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn))加板加板(陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn)、樣陰、陽(yáng)、標(biāo)準(zhǔn)、樣)37, 30min加酶標(biāo)抗體加酶標(biāo)抗體(空孔除外空孔除外)洗滌洗滌3次次, 拍干拍干加底物溶液加底物溶液(空孔除外空孔除外)37, 10-30min加終止液加終止液(空孔除外空孔除外)避光避光上機(jī)檢測(cè)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線上機(jī)檢測(cè)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(空孔調(diào)零空孔調(diào)零)從標(biāo)準(zhǔn)曲線上從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣品含量讀取樣品含量37, 30min洗滌洗滌3次次, 拍干拍干ELISA試驗(yàn)中的注意事項(xiàng)試驗(yàn)中的注意事項(xiàng)必