更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bcl

1、更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bcl    【關(guān)鍵詞】 更年平調(diào)液；,心肌；,更年期大鼠；,bcl 摘 要： 目的： 探討更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法： 選用鼠齡為1115個(gè)月的自然更年期雌性SD大鼠共40只, 隨機(jī)分為4組,即更年平調(diào)液組(P組)、更年期對(duì)照組(M組)、乙烯雌酚組( E組)及更年康組(G組) ,每組10只。另選鼠齡為46 個(gè)月,體重130180 g的SD大鼠10只,為青年對(duì)照組(Y組)。實(shí)驗(yàn)第45d,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組心肌組織中Bcl2的表達(dá)水平，利用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)測(cè)量各組心肌組織中Bcl2表達(dá)的平均

2、光密度和平均陽(yáng)性面積。結(jié)果：更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組、乙烯雌酚組及更年康組之間，Bcl2的平均光密度及陽(yáng)性面積率有顯著性差異(P0.01），更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性(P0.05)。結(jié)論： 更年平調(diào)液能抑制心肌細(xì)胞凋亡而對(duì)心肌細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用。 關(guān)鍵詞： 更年平調(diào)液； 心肌； 更年期大鼠； bcl2； 凋亡； 免疫組織化學(xué)    更年期綜合征即祖國(guó)醫(yī)學(xué)的絕經(jīng)前后諸癥,是更年期婦女發(fā)病率最高的一種病癥，多發(fā)于4555歲婦女。更年期綜合征是婦女進(jìn)入更年期，卵巢功能開(kāi)始衰退后出現(xiàn)的病癥。臨床表現(xiàn)除月經(jīng)紊亂外,還有烘

3、熱出汗、胸悶煩躁、頭昏心慌、失眠多夢(mèng)或精神抑郁、焦慮憂愁等一系列癥候群1，2。更年期平調(diào)液經(jīng)多年臨床應(yīng)用已證實(shí)能明顯改善更年期婦女的心血管癥狀,減慢心率,改善心室功能1,2，但作用機(jī)理尚未闡明。本研究則采用免疫組織化學(xué)方法,觀察了平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌組織內(nèi)bcl2的表達(dá)，以此研究更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌保護(hù)作用的機(jī)理。 1 材料與方法 11 動(dòng)物分組及處理選用鼠齡為1115個(gè)月的自然更年期雌性SD大鼠, 體重250350g,并經(jīng)陰道細(xì)胞涂片,證實(shí)屬更年期者共40只,作為本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?0只更年期動(dòng)物隨機(jī)分為4組：即更年平調(diào)液組(P組) 、更年期對(duì)照組(M組) 、乙烯雌酚組(E組) 及更

4、年康組(G組) ,每組10只。另選鼠齡為46個(gè)月,體重130180 g的SD大鼠10只,為青年對(duì)照組( Y組)。各組動(dòng)物處理如下：更年平調(diào)液組：更年平調(diào)液制劑(WV =180 %) ,20 mlkg 體重,相當(dāng)生藥30 gkg 體重,每日一次灌胃,連續(xù)45 d；更年期對(duì)照組：生理鹽水灌胃,20 mlkg體重,用法同前；乙烯雌酚組：乙烯雌酚片劑溶于水,濃度為1. 25 gL ,用量為20 mlkg體重,用法同上；更年康組:更年康片劑溶于水,成3 %濃度,用量為20 mlkg體重,相當(dāng)生藥0. 6 gkg體重；青年對(duì)照組:處理方法同更年期對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取各組心肌組織做免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。 12

5、 實(shí)驗(yàn)用藥劑更年平調(diào)液由枸杞、肉芙蓉、制首烏、女貞子及龍齒等12 味中藥組成,由武漢大學(xué)中南醫(yī)院藥廠配制成180 %(W/ V) 制劑； 更年康片:為石家莊新華制藥廠產(chǎn)品,批號(hào)9005112 ；乙烯雌酚片:為廣州濟(jì)光制藥廠產(chǎn)品,批號(hào)900803 。 13 免疫組織化學(xué) 131 主要試劑 濃縮型鼠抗人Bcl2單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）； 超敏即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新公司）； DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中山生物技術(shù)有限公司）。 132 主要儀器 YWY781型醫(yī)用微波儀（250W，50Hz），浙江臨安電子器材廠生產(chǎn)；家用高壓鍋。 14 方法 141 免疫組

6、織化學(xué)SP法檢測(cè)Bcl2相關(guān)抗原主要步驟： 組織切片5 m，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗； 3%過(guò)氧化氫，37孵育10 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗4×5min； Bcl2采用微波抗原修復(fù)（3檔，10 min），PBS洗4×5min； 正常羊血清37孵育10 min以減少非特異性反應(yīng)； 一抗（Bcl2，1:50)37孵育1 h，PBS洗4×5min； 生物素標(biāo)記的二抗，37孵育10 min，PBS洗4×5min； 鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶復(fù)合物37孵育10 min，PBS洗4×5min； DAB顯色液顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)； 蘇木

7、精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，人扁桃體作為Bcl2的陽(yáng)性對(duì)照組。 142 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷Bcl2胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，胞核和胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）對(duì)Bcl2的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400)，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽(yáng)性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽(yáng)性面積率的平均值作為該例的測(cè)量值。（陽(yáng)性面積率單位面積中陽(yáng)性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積&

8、#215;100） 143 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性顆粒的平均光密度、陽(yáng)性面積率作單因素方差分析和SNKq檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。 2 結(jié)果 21 Bcl2的表達(dá)更年平調(diào)液組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒密集，Bcl2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；更年期對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)無(wú)棕黃色顆粒，Bcl2無(wú)表達(dá)；乙烯雌酚組及更年康組胞漿內(nèi)棕黃色顆粒較少，呈彌散分布，Bcl2呈弱陽(yáng)性表達(dá)；青年對(duì)照組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒密集，Bcl2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。圖像分析結(jié)果見(jiàn)表1。經(jīng)單因素方差分析，組間有顯著性差異（P0.01)。經(jīng)q檢驗(yàn)，更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組、乙烯雌酚組及更年康組之間，Bcl2的平均光密度及陽(yáng)

9、性面積率有顯著性差異(P0.01)，更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性(P0.05)。    表1 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞Bcl2表達(dá)的平均光密度和陽(yáng)性面積率（略）    3 討論 婦女一般在45 52歲之間, 平均48歲左右,月經(jīng)便停止。在月經(jīng)將絕未絕的1 2年間,出現(xiàn)的植物神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂為主的臨床證候群，主要表現(xiàn)為陣發(fā)性烘熱, 熱后出汗, 汗后畏寒, 或夜間盜汗, 常伴胸悶心悸、煩躁、易怒、眩暈、憂郁、精神萎靡等癥狀, 統(tǒng)稱為更年期綜合征。女性更年期卵巢功能逐

10、漸減退,體內(nèi)性激素水平逐漸減低3。在此時(shí)期,部分婦女由于性激素減少引起骨質(zhì)疏松以及因植物神經(jīng)功能紊亂而產(chǎn)生心血管、生殖器官等癥狀。突出表現(xiàn)為心血管功能不穩(wěn)定4，5 。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,更年期綜合癥是由于腎氣漸衰,精血不足,沖任脈虧損而致的陰陽(yáng)平衡失調(diào),對(duì)于此癥,用補(bǔ)腎法效果甚佳6，7 。細(xì)胞凋亡(apoptosis)8是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定由基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。它是細(xì)胞在一定條件下，通過(guò)啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制，引起內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生細(xì)胞的自然死亡。細(xì)胞凋亡的過(guò)程不導(dǎo)致溶酶體及胞膜的破裂，沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄，所以不引起炎癥反應(yīng)。bcl2基因是1984年由Tsu

11、jimoto9等從濾泡性B細(xì)胞淋巴瘤中分離出來(lái)的一種原癌基因。Vaux等10首先報(bào)道，bcl2基因可明顯延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，但并不促進(jìn)細(xì)胞的增殖。而后的研究發(fā)現(xiàn)，bcl2基因可抑制多種組織細(xì)胞的凋亡，故將其稱為凋亡抑制基因。bcl2基因并不像其他癌基因那樣加速細(xì)胞分裂，它的作用是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命。bcl2基因表達(dá)產(chǎn)物Bcl2是一種分子量為26kD的蛋白，主要存在于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。在其氨基酸的C末端有一由9個(gè)氨基酸組成的疏水性片斷，并借此與膜相連。Bcl2蛋白羧基端的跨膜區(qū)域?qū)cl2蛋白發(fā)揮抑制凋亡功能起決定性作用。bcl2基因通過(guò)編碼Bcl2蛋白而發(fā)揮抗凋亡作用，

12、具體機(jī)制可能是：Bcl2蛋白位于線粒體上，通過(guò)抑制氧自由基的產(chǎn)生或起一種抗氧化劑的作用，而產(chǎn)生抗凋亡作用11；細(xì)胞凋亡中DNA的消化需要相關(guān)的Ca2 依賴性核酸內(nèi)切酶參與，Bcl2通過(guò)阻斷Ca2 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制12；細(xì)胞凋亡時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C（cytochrome c）減少及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素增加，而B(niǎo)cl2主要定位于線粒體上，Bcl2可能通過(guò)影響線粒體釋放細(xì)胞色素C的過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)凋亡13。本實(shí)驗(yàn)用更年平調(diào)液給更年期大鼠灌胃,經(jīng)免疫組織化學(xué)方法顯示, 更年平調(diào)液組心肌細(xì)胞Bcl2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；更年期對(duì)照組心肌細(xì)胞Bcl2無(wú)表達(dá)；乙烯雌酚組及更年康組Bcl2呈弱陽(yáng)性表達(dá)；青年對(duì)

13、照組心肌細(xì)胞Bcl2呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。經(jīng)q檢驗(yàn)，更年平調(diào)液組與更年期對(duì)照組、乙烯雌酚組及更年康組之間，Bcl2的平均光密度及陽(yáng)性面積率有顯著性差異(P0.01)，更年平調(diào)液組與青年對(duì)照組比較平均光密度及陽(yáng)性面積率的差異無(wú)顯著性(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明乙烯雌酚可補(bǔ)充更年期卵巢功能衰退時(shí)雌激素的不足。更年康的作用是扶正固本,益氣健脾及補(bǔ)腎安神,為市售成藥,用于治療更年期心血管癥狀。乙烯雌酚組或更年康組與更年期對(duì)照組比較,差別也有顯著性(P<0.05) ，表明乙烯雌酚和更年康對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞起一定的保護(hù)作用,但更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用優(yōu)于乙烯雌酚和更年康,因更年平調(diào)液中的枸

14、杞、肉芙蓉、制首烏及女貞子具有補(bǔ)肝腎、益精血、調(diào)沖任之功效,龍齒能平肝潛陽(yáng),鎮(zhèn)靜安神,諸藥合用使肝腎之陰得補(bǔ),陽(yáng)亢得抑,其目的是使“陰平陽(yáng)秘”,以平為度。并且在中醫(yī)學(xué)理論中,心為火,腎為水,水火相濟(jì),心腎功能方能維持平衡,因此可用補(bǔ)腎法來(lái)調(diào)節(jié)心臟功能。更年平調(diào)液抑制細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞存活的作用，對(duì)心肌細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用。    參 考 文 獻(xiàn) 1 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化學(xué)分會(huì)腸易激綜合征共識(shí)意見(jiàn). 中華消化雜志,2003，23 (7) :427428. 2 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 中藥新藥治療肝郁脾虛證的臨床研究指導(dǎo)原則. 中藥新藥指導(dǎo)原則, 1993，96

15、. 3 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部 中藥新藥治療泄瀉的臨床指導(dǎo)原則. 中藥新藥指導(dǎo)原則, 1993，127128. 4 熊舜華,程化奇,殷新尤,等. 更年平調(diào)液對(duì)更年期大鼠作用的實(shí)驗(yàn)研究. 湖北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1994,15(1) :72. 5 徐江. 大鼠更年期綜合癥心功能變化的探討. 武漢醫(yī)學(xué)雜志,1993，1 :19. 6 徐澄. 補(bǔ)腎寧片治療更年期綜合癥92 例近期療效分析. 山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1985,9 (2) :9. 7 陸啟濱,夏桂成,陳丹華,等. 更年新方治療更年期綜合癥的臨床觀察. 中西醫(yī)結(jié)合雜志,1991,11 (9) :535. 8 金惠銘，盧建，殷蓮華，主編. 細(xì)胞分子病理生

16、理學(xué). 鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2002，369370. 9 Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t (14:18) chromosome translocation. Science, 1984, 226 (4768): 10971099. 10 Vaux DL, Cory S, Adams JM. Bcl2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with cMyc to immortalise preB cells. Nature， 1988, 335(6189): 440442 11 Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, et al. Bcl2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell， 1993 75(2): 241251. 12 Lam M, Dubyak G, Chen L, et al. Evidence that Bcl2 represses apoptosis by regulating