小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測定方法研究

1、小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測定方法研究 作者：魏大華，馮敬文，王四元，龍曉英，陳金愛【摘要】 目的 建立反相高效液相色譜法測定小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量。方法 采用DiamonsiLTM C18(250 mm4.6 mm，5 m)色譜柱，乙腈?蔡寤?分數(shù)0.4%H3PO4水溶液(體積比1090)為流動相，流速為1 mL?min-1，檢測波長為327 nm,柱溫為30 。結果 綠原酸在質量濃度為16.2881.4 g范圍內線性關系良好(r=0.999 6，n=5)，樣品平均回收率為100.31%，RSD為1.45%。結論 本法簡便、快速、準確，適用于小兒清熱利肺口服液的質量控制。

2、 【關鍵詞】 小兒清熱利肺口服液;高效液相色譜法;綠原酸;含量測定Abstract:Objective To establish a RP?HPLC method for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei ioral solution. Methods The assay was performed on DiamonsiLTM C18 column with the mobile phase of acetonirile?0.4% phosphoric acid solution (1090

3、) under a flow rate of 1 mL?min-1. The detection wavelength was set at 327 nm and column temperature was 30 . Results It showed good linearity in the range of 16.28-81.4 g of chlorogenic acid (r=0.999 6,n=5).The average recovery was 100.31% (RSD=1.45%). Conclusion The method is simple,rapid,accurate

4、 and can be used for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei oral solution.Key words:Xiaoer Qingre Lifei oral solution; HPLC; chlorogenic acid; determination小兒清熱利肺口服液由銀翹散和麻杏石甘湯2個古方合方化裁而成，處方由金銀花、連翹、牛蒡子、麻黃、等11味中藥組成1，主治外感風熱邪在肺衛(wèi)或衛(wèi)氣同病之風熱咳嗽，用于發(fā)熱、咳嗽，咯痰、流涕或鼻塞、咽痛、口渴、舌紅黃等證候的小兒急性支氣管

5、炎。其中綠原酸為金銀花的主要活性成分，在牛蒡子中含量亦較高。它是一種具有廣泛生理和藥理活性的物質，具有利膽、抗菌、降壓、增加白細胞及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降脂、清除自由基等多種藥理作用2。小兒清熱利肺口服液現(xiàn)有質量標準采用紫外分光光度法測定其鹽酸麻黃堿含量，并未以綠原酸為含量測定指標。因此，本實驗建立高效液相色譜法測定小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量，旨在為完善小兒清熱利肺口服液的質量標準提供基礎。1 儀器與試藥LC?20A高效液相色譜儀(日本島津)，SPD紫外檢測器，二元高壓梯度泵;BP211D電子分析天平(Satorius);UV?2450可見?滄賢夥止夤舛紉?(日本島津); HH?

6、6恒溫水浴鍋(宏華新佳);綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110753?200413);小兒清熱利肺口服液(廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司提供，批號：E06002、F03002B、F10001B、I11002B);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。廣東藥學院學報 第26卷 第4期 魏大華,等.小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測定方法研究 2 方法與結果2.1 色譜條件色譜柱：DiamonsiLTM C18(250 mm4.6 mm，5 m)柱;流動相：乙腈?蔡寤?分數(shù)0.4% H3PO4水溶液(體積比1090);流速：1 mL?min-1;檢測波長：327 nm;柱溫：30 ;進樣量

7、：20 L。2.2 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品(于室溫用P2O5干燥24 h)8.14 mg，置20 mL棕色容量瓶中，加50%(體積分數(shù))甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密吸取綠原酸對照品貯備液2 mL置于25 mL容量瓶中，用50%(體積分數(shù))甲醇稀釋制成每1 mL含綠原酸 0.032 6 mg的對照品溶液。2.3 供試品溶液的制備精密吸取小兒清熱利肺口服液1 mL至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇層于70 水浴蒸干，殘渣用50%(體積分數(shù))甲醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，用0.45 m微孔薄膜濾過，即得。2.4 陰性對照溶

8、液的制備稱取處方組成中除金銀花和牛蒡子外的其余藥材，按照生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，并按“2. 3”項下方法制備，即得陰性對照溶液。2.5 系統(tǒng)適用性試驗分別緊密吸取對照品、供試品、陰性對照溶液各20 L注入液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。在此條件下，陰性對綠原酸測定無干擾，綠原酸和其他組分可達到基線分離，分離度R5。理論塔板數(shù)以綠原酸計，應不低于 1 000。結果見圖1。2.6 線性關系考察精密吸取“2.2”項下綠原酸對照品貯備液各1、2、3、4、5 mL，分別至25 mL棕色容量瓶中，加50%(體積分數(shù))甲醇稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸質量濃度分別為16.28、32.5

9、6、48.84、65.12、81.4 g?mL-1的系列對照品溶液。分別精密吸取20 L進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標，綠原酸對照品量(X，g)為橫坐標進行線性回歸，求得回歸方程為：Y=6.2465104X-3.6896104，r=0.999 6。結果表明,綠原酸在16.2881.4 g范圍內，與峰面積呈良好線性關系。2.7 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液20 L注入液相色譜儀，重復進樣5次，按“2.1”項下色譜條件測定綠原酸峰面積，結果RSD值為1.51%(n=5)，表明儀器精密度良好。2.8 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品(批號E06002)溶

10、液，于0、4、8、12、18、24 h分別進樣，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積。結果RSD值為1.60%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。2.9 重復性試驗取同一批號(批號F03002B)小兒清熱利肺口服液6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定。結果綠原酸含量的RSD值為0.19%(n=6)，表明本方法重復性良好。2.10 加樣回收率試驗精密吸取小兒清熱利肺口服液(批號I11002B)適當稀釋后的藥液共6份(綠原酸質量濃度為0.842 7 mg?mL-1)，分別加入綠原酸對照品溶液適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下方法測定綠

11、原酸的含量，計算回收率。結果見表1。表1 加樣回收率試驗結果2.11 樣品測定取小兒清熱利肺口服液3批 (批號E06002、F03002B、F10001B)，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，以外標法計算綠原酸的含量。結果3個批號樣品的質量濃度分別為2.331、1.861、1.928 mg?mL-1，RSD值依次為0.48%、1.09%和0.77%。3 討論3.1 綠原酸為金銀花的特征有效成分。本實驗在去除金銀花的陰性對照液中檢測出較高含量的綠原酸(見圖2)，并通過實驗發(fā)現(xiàn)綠原酸在牛蒡子中含量較高。曾有關于在牛蒡葉中提取綠原酸的文獻報道3，但未見牛蒡子中檢測出綠原酸的報道。本研

12、究這一發(fā)現(xiàn)不僅提高了牛蒡子藥材的可利用度，同時也可作為其質量控制的指標之一。3.2 對綠原酸對照品溶液在200400 nm處進行紫外光譜掃描檢測，結果顯示綠原酸在217、240、327 nm處均有最大吸收，選擇干擾較少的327 nm作為檢測波長。3.3 對不同比例的乙腈?H3PO4水溶液4作為流動相的分離效果進行了考察，發(fā)現(xiàn)當二者的體積比為1090，綠原酸與相鄰雜質峰分離效果最好，保留時間適中。H3PO4水溶液的體積分數(shù)為0.4%時，峰形對稱。因此，選擇乙腈?蔡寤?分數(shù)0.4% H3PO4水溶液(體積比1090)作為流動相。3.4 小兒清熱利肺口服液為11味中藥組成的大復方，成分非常復雜，因而

13、，供試品制備方法的選擇難度較大。曾嘗試用甲醇對樣品液進行超聲提取，提取液直接進樣檢測。檢測結果表明，綠原酸峰與其它雜質峰達到基線分離耗時較長，且由于目標峰后還有較多雜質峰，為不干擾下一樣品的檢測必須等待90 min以上才可進樣。為改善分離效果，對甲醇提取液采用中性氧化鋁柱柱與大孔吸附樹脂5進行純化，結果發(fā)現(xiàn)，二者分離純化的效果并不理想，且操作繁瑣。故嘗試使用溶劑萃取法對樣品進行處理，并對乙酸乙酯與水飽和正丁醇的萃取2效果進行了比較。結果表明，2種溶劑所得萃取液的色譜圖基本相同，峰形、峰時一致，但乙酸乙酯萃取液的峰面積較小，說明乙酸乙酯萃取時綠原酸損失較多，其主要原因是綠原酸微溶于乙酸乙酯。因此

14、，確定樣品采用水飽和正丁醇萃取，不僅能有效去除雜質，且綠原酸損失較少，操作簡便、快速。對萃取溶劑用量與萃取次數(shù)考查結果表明，20倍水飽和正丁醇萃取2次與15倍水飽和正丁醇萃取3次所得萃取液中綠原酸的含量較低;10倍水飽和正丁醇萃取3次較20、30倍水飽和正丁醇萃取3次所得萃取液中綠原酸的含量低;10倍水飽和正丁醇萃取4次所測得綠原酸含量與20、30倍水飽和正丁醇萃取3次的含量基本一致，且高于5倍水飽和正丁醇萃取4次的含量。因此，確定水飽和正丁醇用量為10倍量，萃取次數(shù)為4次。3.5 本研究建立的綠原酸含量測定方法簡便快速、分離度好、靈敏度高，可用于小兒清熱利肺口服液的質量控制。【參考文獻】 1 易明娟,謝子清,譚億明,等.清熱利肺口服液的藥理研究J.成都中醫(yī)藥大學學報,1997