HPV16E6蛋白免疫膠體金診斷試紙條的制備論文

1、本論文資料來源于重慶市教委資助的科研項(xiàng)目：高危型人乳頭瘤病毒免疫膠體金試紙條的研制,項(xiàng)目編號： KJ070615。胡仁建 1968年出生，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事疫苗與診斷技術(shù)的研究?？笻PV16E6蛋白單抗在HPV16型快速診斷方法中的應(yīng)用 胡仁建 蔡家利 徐佳緣 張貴 梁曉媛 李夏慶 郭萍 鄭洋（ 重慶理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，中國，重慶，400050）目的： 建立一種快速、準(zhǔn)確、簡便檢測高危型人乳頭瘤病毒16型的膠體金診斷試紙條，以用于宮頸癌的早期篩查。方法：用檸檬酸三鈉還原法制備30 nm的膠體金顆粒；用目測法確定抗HPV16E6蛋白單克隆抗體（4D4株）的最適穩(wěn)定標(biāo)記量后，用膠體金顆粒

2、標(biāo)記單抗，用離心法純化金標(biāo)抗體；選擇7種樣品墊處理液和7種結(jié)合墊處理液分別處理樣品墊和結(jié)合墊；采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，取3因素、3水平進(jìn)行金標(biāo)抗體（單抗）、抗HPV16E6蛋白多抗、兔抗鼠IgG噴涂量的確定；將金標(biāo)抗體噴涂在結(jié)合墊上作為捕獲線、將多抗噴涂在NC膜上作為檢測線、將兔抗鼠IgG噴涂在NC膜上作為質(zhì)控線，組裝成HPV16型的免疫膠體金診斷試紙條；取HPV16E6蛋白和HPV16L1蛋白溶液，滴于測試條的下端，反應(yīng)1015min，若膠體金診斷試紙條上質(zhì)控線、檢測線都為紅色，則說明為陽性，若只有質(zhì)控線為紅色則判為陰性，如果兩條線均無顯色則為測試條失效。結(jié)果：成功地制備了酒紅色的30nm膠體金顆

3、粒; 用于標(biāo)記的抗HPV16E6蛋白單克隆抗體（4D4株）的最適穩(wěn)定標(biāo)記量為5ug/ml,實(shí)際標(biāo)記量為6ug/ml,制備和純化了穩(wěn)定的金標(biāo)抗體溶液；第7種樣品墊處理液和第7種結(jié)合墊處理液效果最好；第四種噴涂量效果最好；試紙條檢測HPV16E6蛋白為陽性，檢測HPV16L1蛋白為陰性。結(jié)論：用檸檬酸三鈉還原法制備了亮紅色的30 nm膠體金顆粒；膠體金顆粒標(biāo)記的單抗的實(shí)際標(biāo)記量為6ug/ml,選用了兩種穩(wěn)定劑BSA和PEG20000獲得了穩(wěn)定的金標(biāo)抗體溶液；第7種樣品墊處理液和第7種結(jié)合墊處理液處理樣品墊和結(jié)合墊組裝的試紙條效果最好；試紙條檢測HPV16E6蛋白為陽性，檢測HPV16L1蛋白為陰性

4、。關(guān)鍵詞 ：人乳頭瘤病毒16型；宮頸癌； 膠體金；單克隆抗體；多克隆抗體；試紙條。 AbstractObjective: To establish a rapid, accurate and easy colloidal gold diagnostic strip for detection high-risk human papillomavirus type 16,to screen cervical cancer in the early stage. Methods: The 30 nm colloidal gold particles were prepared by Tri-sod

5、ium citrate reduction method; the optimal amount for labeling of anti-HPV16E6 protein monoclonal antibody (McAb) were determined by the visual method ,these monoclonal antibodies were labeling by 30 nm colloidal gold particles,these gold-labeled antibodies were purified by centrifugation; seven kind

6、s liquid for processing samples pads and seven kinds liquid for processing conjugation pads were used; using orthogonal experimental method, three factors and three levels were designed to determine spray volume of gold-labeled antibody (McAb), anti-HPV16E6 protein polyclonal antibody, rabbit anti-m

7、ouse IgG; gold-labeled antibodies were sprayed on the conjugation pad as the capture line、 anti-HPV16E6 protein polyclonal antibodies and rabbit anti-mouse IgG antibodies were sprayed on NC membrane as the test and quality control line respectively, the immuno-colloidal gold test strips for detectio

8、n HPV16 type were assembed; HPV16E6 protein and strips for 10-15min, if the test line and quality control line of the test strip appears red, it is a positive result, if only the quality control line appears red,it is a negative result, if the two lines do not appears red , the test strip were expir

9、ed. Results: The 30nm colloidal gold particles were successfully ; for labeled anti-HPV16E6 protein monoclonal antibody (4D4 strain) the optimal labeling amount of McAbs were 5ug/mland the actual labeling amount were 6ug/ml, the stable gold-labeled antibody solutions were preparated and puried;the s

10、eventh kind liquids of processing samples pads and conjugation pads were best;the fourth kind of spray fourth amount was the best choice;these test strips were used to detect HPV16E6 protein as positive results ,HPV16L1 protein as negative results. Conclusion: The 30 nm colloidal gold particles was

11、prepared by Tri-sodium citrate reduction method; the actual labeling amount of McAbS were 6ug/ml;because two kinds of stabilizers BSA and PEG20000 were used to obtain stable gold-labeled antibody solutions; the seventh kind liquids of processing samples pads and conjugation pads were best;the fourth

12、 kind of spray fourth amount was the best choice; hese test strips were used to detect HPV16E6 protein as positive results ,HPV16L1 protein as negative results.Key words: human papillomavirus type 16; cervical cancer; colloidal gold; monoclonal antibody; polyclonal antibody; test strip. 1 引言HPV感染是宮頸

13、上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）和宮頸癌的明確病因1。 Mattheus2等報(bào)道，在99.7的浸潤性宮頸癌中可以檢測到13種高危型HPV，其中HPV16（53%）、HPV18（15%）等高危型的感染是引起宮頸癌變的首要因素。宮頸癌與高危型HPV感染關(guān)系密切，其自然病程有一個從宮頸上皮不典型增生到原位癌再到浸潤癌的一個連續(xù)發(fā)生、發(fā)展過程大約有10年的時(shí)間，所以做好癌前篩查是防治宮頸癌的關(guān)鍵所在【3，4】。高危型HPV感染可導(dǎo)致宮頸癌及宮頸癌前病變（CIN），而持續(xù)性HPV感染與CIN病變進(jìn)展的關(guān)系又甚為密切，故高危型HPV檢測對宮頸癌的早期篩查、防治及在預(yù)測CIN的自然轉(zhuǎn)歸、治療后的隨診上都有重要的作用

14、【5】。目前采用的HPV檢測方法都有共同的局限：費(fèi)時(shí)和操作程序復(fù)雜。本課題研制的高危型人乳頭瘤病毒16型免疫膠體金試紙條，能達(dá)到可在各級醫(yī)院使用的快速特異診斷高危型人乳頭瘤病毒16型感染的目的。本課題選擇的免疫膠體金層析【6；7，8】(Goldimmunochromatography assay，GICA)是一種將膠體金標(biāo)記免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。免疫膠體金快速診斷技術(shù)具有操作方便，易于判定，特異性好，靈敏度高，快捷迅速等優(yōu)點(diǎn)，在檢測樣品時(shí)只需要510分鐘即可判斷結(jié)果，因此可達(dá)到快速診斷的目的。2材料與方法2.1 主要儀器及設(shè)備磁力加熱攪拌器，

15、 美國BIO-RAD； 低溫離心機(jī) 德國Sigma； 電子天平， 德國Sartorius； 超純水器 ，美國Millipore；微量點(diǎn)樣機(jī) 美國BIO-RAD； 135硝酸纖維膜（NC）， 美國Whatman；玻璃纖維膜，美國Whatman等。2.2 主要試劑抗HPV16E6蛋白單抗和多抗、兔抗鼠IgG抗抗體由本文作者制備；氯金酸， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； PVA， 美國Sigma； PVP ，美國Sigma； BSA， 美國Roche； 碳酸鉀， 中國成都化學(xué)試劑廠； 四硼酸鈉 ，北京紅星化工廠； 檸檬酸三鈉，Sigma等。2.3 方法2.3.1 30nm膠體金顆粒的制備：據(jù)參考資料，本

16、實(shí)驗(yàn)初步確定用30nm的膠體金，參照彭伏虎【3】膠體金試紙條檢測H9亞型禽流感病毒的研究，取0.01%HAuCL200ml倒入500ml平底燒瓶中，加熱煮沸，快速加入3.6ml 事先預(yù)熱至37oC1%檸檬酸三鈉，再加熱15分鐘，自然冷卻至室溫并補(bǔ)水至200ml，用0.1mol/L 的K2CO3溶液調(diào)pH至8.2。2.3.2 待標(biāo)記蛋白（抗HPV16E6蛋白腹水型單抗）的純化： 用辛酸-硫酸銨法純化單抗腹水13ml。2.3.3 用目測法確定抗HPV16E6蛋白單抗的最適標(biāo)記量：按表1因待標(biāo)記蛋白為單抗，所以將膠體金溶液的pH調(diào)至8.2之后，分裝9管，每管1ml，將標(biāo)記的單抗以0.005mol/L

17、 pH8.2硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為1.25µg/ml30µg/ml，分別取1ml，加入上列膠體金溶液中，混勻，對照管只加1ml稀釋液，5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。表1 待標(biāo)記單抗體最適穩(wěn)定量的確定 1 2 3 4 5 6 7 8 9膠體金（ml） 1 1 1 1 1 1 1 1 1蛋白質(zhì)（g） 1.25 2.5 5 10 15 20 25 30 010%NaCl(ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1金標(biāo)抗體的制備與純化將膠體金和單抗溶液分別以0.1mol/L K2CO3調(diào)pH

18、至8.2，取30ml膠體金溶液，快速電磁攪拌下，將4D4單抗溶液180ug緩慢加入膠體金溶液30ml中 ，室溫繼續(xù)攪拌45分鐘，加入5胎牛血清（BSA）2.5ml,使BSA終濃度為0.4%，攪拌5分鐘,分裝，1500r/min,4離心15分鐘，棄掉沉淀，上清用0.45um過濾器過濾除去聚合體后，在12000r/min，4離心30分鐘，沉淀用含0.5%PEG20000的0.005mol/LPBS（pH7.2）重懸沉淀至原體積，12000r/min，重復(fù)4離心2次，用0.5ml含1%BSA的2mol/L的硼酸緩沖液重懸沉淀, 4保存?zhèn)溆谩?結(jié)合墊、樣品墊處理液的選擇經(jīng)過大量試驗(yàn)和文獻(xiàn)資料，最后確定

19、設(shè)計(jì)六種pH7.5和一種pH7.4的結(jié)合墊處理液，如下表2所示，將結(jié)合墊（玻璃纖維膜）浸泡其中三小時(shí)，烘干，噴樣，觀察結(jié)合墊釋放金標(biāo)抗體的效果。表2 結(jié)合墊處理液設(shè)計(jì)表試劑 編號Na2B4O710H2O（mM）707080809090PVA (%)0.10.20.20.20.10.1Tween-20 (%)0.20.20.20.10.10.1BSA (%)0.30.30.30.30.30.2 編號試劑pH7.4的PBS（mmol/L）10BSA（%）2.0吐溫-20（%）1.0蔗糖（%）2.5PVP-100.3如表3所示，設(shè)計(jì)六種Ph9.6-10和一種pH7.4的樣品墊處理液，將樣品墊（玻璃纖

20、維膜）浸泡其中三小時(shí)，烘干，組裝試劑條后，觀察樣品液流速及非特異性反應(yīng)程度。 表3樣品墊處理液設(shè)計(jì)表試劑 編號Na2B4O710H2O（mM）707070100100100PVP (%)0.10.20.20.20.20.2Triton-100(%)0.20.20.30.30.30.2BSA (%)0.30.30.30.30.20.2 編號試劑pH7.4的PBS（mmol/L）10BSA（%）2.0吐溫-20（%）1.0蔗糖（%）2.5PVP-100.32.3.6結(jié)合墊、樣品墊的預(yù)處理將結(jié)合墊（玻璃纖維素膜）、樣品墊裁剪成適當(dāng)尺寸，浸泡在處理液中至少三小時(shí)以上，烘干（至少16小時(shí)）備用。2.3.

21、7 金標(biāo)抗體、單克隆抗體、兔抗鼠IgG噴涂量的確定采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表4所示，評價(jià)指標(biāo)是在檢測陽性樣本時(shí)檢測線和質(zhì)檢線均清晰的出現(xiàn)。表4 抗體噴涂量的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表 抗體噴涂量試驗(yàn)號金標(biāo)抗體(OD520=0.60)兔抗鼠IgG（1.2966ug/ml）HPV16E6單抗（0.12496ug/ml）11.50.50.421.50.750.831.51.01.242.00.50.852.00.750.462.01.01.272.50.51.282.50.750.492.51.00.8 2.3.8 噴涂將金標(biāo)抗體、單抗、兔抗鼠IgG制成工作濃度，噴涂在結(jié)合墊和NC膜上，置烘箱20-30分鐘，保存。

22、2.3.9免疫試紙條的組裝根據(jù)MQller-Bardoff法改進(jìn)。整個測試條由2層吸水玻璃纖維，1層硝酸纖維素膜，吸水濾紙及白色塑料墊板組成。將吸水紙、包被NC膜（包被有多克隆抗體(檢測線)及兔抗鼠IgG(對照線)、噴涂玻璃纖維（金標(biāo)抗體）從上到下依次固定于白色塑料板上，裁切成0.4cm×5cm條，與于燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封4貯存。2.3.10 檢測方法分別用HPV16E6和HPV16L1蛋白原液檢測，滴在試紙條下端，反應(yīng)10-15min2.3.11評判標(biāo)準(zhǔn)若在測試條上方僅出現(xiàn)一條紅帶，則表示為陰性；若在測試條上方出現(xiàn)二條紅帶，則表示為陽性：若在測試條上方不出現(xiàn)紅帶，則表示測試條

23、失效。3結(jié)果3.1 待標(biāo)記單抗最適穩(wěn)定量的確定本次實(shí)驗(yàn)?zāi)繙y法結(jié)果是在單抗為1.25ug、2.5ug、5ug和0ug這4個管出現(xiàn)藍(lán)色沉淀，其余的試管的顏色都沒有改變，所以可以確定4D4單抗的最適穩(wěn)定量是 5µg/ml。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需抗體的實(shí)際用量是6µg/ml。結(jié)果見圖1。圖1 待標(biāo)記單抗最適穩(wěn)定量的確定3.2 膠體金溶液的A520值測定結(jié)果膠體金顆粒在波長510nm550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。本次制備的30nm膠體金顆粒的最大吸收值峰在520nm,用0.02mol/L pH8.2 PBS液（含1BSA，0.02NaN3）將膠體金蛋白試劑作1：20稀釋

24、，A5200.25左右。一般應(yīng)用液的A520應(yīng)為0.20.4。3.3結(jié)合墊和結(jié)合墊處理液的選擇如圖2，編號為 的結(jié)合墊和樣品墊處理液浸泡過的玻璃纖維膜釋放金標(biāo)抗體的效果最好。 圖7.5 不同緩沖液液浸泡過的結(jié)合墊釋放金標(biāo)抗體效果3.4 金標(biāo)抗體、抗HPV16E6蛋白多抗、兔抗鼠IgG噴涂量的確定結(jié)果如圖3所示，正交試驗(yàn)結(jié)果，4號效果最好，當(dāng)稀釋10倍后A5200.60的金標(biāo)抗體噴量為2.0µl/cm，兔抗HPV16E6多抗（4.5mg/ml)噴量0.8µl/cm，兔抗鼠IgG (6.0mg/ml)噴量為0.5µl/cm時(shí)檢測線、質(zhì)控線最為清晰。1 2 3 4 5

25、6 7 8 9 陰性 圖3 三種抗體噴涂量的選擇3.5 HPV16免疫膠體金試紙條的檢測結(jié)果 HPV16免疫膠體金試紙條檢測HPV16E6蛋白時(shí)檢測線和質(zhì)控線都呈現(xiàn)紅色，結(jié)果為陽性，檢測HPV16L1蛋白，只在質(zhì)控線上出現(xiàn)紅色，結(jié)果為陰性。如圖3所示。 陽性 陰性 圖3 HPV16免疫膠體金試紙條檢測HPV16E6蛋白和HPV16L1蛋白得結(jié)果4 討論與展望4.1膠體金顆粒的制備：本研究選擇的免疫膠體金層析(GoldimmunochromatograpHy assay，GICA)是一種將膠體金標(biāo)記免疫檢測技術(shù)和層析分析技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合在一起的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。該技術(shù)涉及摸索眾多的實(shí)驗(yàn)

26、參數(shù)，數(shù)據(jù)較多，工作量很大。膠體金標(biāo)記免疫檢測技術(shù)涉及所用的玻璃器皿必須泡酸清洗得很潔凈，否則影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比如在制備金顆粒時(shí)，三角錐瓶必須泡酸用超純水清洗得很干凈，否則制備的金顆粒溶液不呈亮的酒紅色，而呈紫色，不是好的金顆粒，會影響金標(biāo)單抗的穩(wěn)定性，從而影響試紙條的有效性。在加入1%的枸櫞酸三鈉時(shí)要迅速，同時(shí)要攪拌，否則得到的金顆粒不均勻一致。好的金顆粒的獲得為金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。4.2 金標(biāo)抗體的制備和純化：膠體金標(biāo)記蛋白時(shí)，一定要確定最佳的pH值和最適抗體標(biāo)記量，才能確保金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性，金標(biāo)抗體的穩(wěn)定性直接影響試紙條的有效性和靈敏度等。本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的蛋白是單抗，所以標(biāo)記時(shí)的膠體金顆

27、粒和單抗的pH值均調(diào)至8.2，本實(shí)驗(yàn)通過目測法確定了最適單抗標(biāo)記量為5ug/ml，在實(shí)際標(biāo)記中增加了20%，所實(shí)際的標(biāo)記量為6ug/ml。接著，在標(biāo)記時(shí)通過加入BSA和PEG20000兩種穩(wěn)定劑的比較，發(fā)現(xiàn)選用含BSA和PEG20000的金標(biāo)抗體更穩(wěn)定；在純化洗滌金標(biāo)抗體時(shí)選用含PEG20000的pH為7.2的0.005mol/L的PBS更穩(wěn)定，金標(biāo)抗體穩(wěn)定性時(shí)間的長短與試紙條的穩(wěn)定性長短相關(guān)。4.3 樣品墊和結(jié)合墊處理液的選擇：不同的樣品墊和結(jié)合墊處理液處理樣品墊和結(jié)合墊后組裝的試紙條在檢測樣品時(shí)，同一條件下釋放樣品和金標(biāo)抗體的效果不一樣，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第7種樣品墊和結(jié)合墊處理液的配方最利于樣品和金標(biāo)抗體的釋放。4.4 金標(biāo)抗體、多抗、兔抗鼠IgG的最佳噴涂量的確定：通過按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同的金標(biāo)抗體、多抗、兔抗鼠IgG噴涂量來噴涂，組裝試紙條，然后檢測是紙條的有效性。比較后發(fā)現(xiàn)第4組的噴涂量較好。4.5 試紙條的組裝： 試紙條在組裝時(shí)嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行，才