丙二醛MDA測定

1、丙二醛 MDA 、總抗氧化能力、超氧化物歧化酶（SOD ）的測定丙二醛 MDA 測定測試所需儀器設(shè)備：可見光分光光度計，可調(diào)到 95左右的恒溫水浴箱（或者鋁鍋內(nèi)放幾個去掉蓋子的易拉罐，將罐壁及底部穿數(shù)十個孔，以便水的進(jìn)入，用來代替水浴箱）。離心機(jī)。100試劑盒組成與配制：試劑一：液體 20mL*1 瓶，室溫保存（天冷時會凝固，每次測試前適當(dāng)水浴加溫以加速溶解，直至透明方可應(yīng)用）。試劑二：液體 12mL*1 瓶，用時每瓶加 340mL 雙蒸水混勻，4冷藏。試劑三：粉劑 *1 支， 4冷藏。1. 按規(guī)范操作方法來配制 MDA3號試劑：將 1 支 100的 MDA3號粉劑倒入燒杯內(nèi)加 90 100的

2、熱蒸餾水 64mL,充分溶解（溶解過程中可適當(dāng)加熱） 。冷卻后加冰醋酸 60mL混勻。2. 再將上述配好的 MDA3號試劑用 50冰醋酸按 2：1 進(jìn)行稀釋，用多少配多少。例如您需要用微量法測 MDA需要試劑三為 15mL，則可以取上述按規(guī)范操作法配好的試劑三 10mL加冰醋酸 5mL，混勻即可。配好的試劑避光 4冰箱冷藏（冰醋酸自備）注：因蒸餾水熱脹冷縮，加熱過程要蒸發(fā)，本應(yīng)加60mL現(xiàn)多加4mL，冷卻后在 60mL。50冰醋酸的配制是50mL雙蒸水加 50mL冰醋酸混合而成的。冰醋酸又名乙酸，一般的醫(yī)藥公司、化劑公司均有售，要購 AR 級分析純級的乙酸較好，乙酸含量為 99以上。用時將粉劑

3、加入到 90 100的熱雙蒸水 60mL中，（在溶解過程中可適當(dāng)加熱），充分溶解后用雙蒸水補(bǔ)足至 60mL再加冰醋酸60mL，混勻，配好的試劑避光冷藏。冰醋酸自備。標(biāo)準(zhǔn)品： 10nmoL/mL 四乙氧基丙烷 5mL*1 瓶， 4冷藏。測試盒冷藏至少可保存一年。操作步驟：標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)空白測定管測定空白管管*10nmoL/mL 標(biāo)準(zhǔn)品a*（mL）無水乙醇（ mL ）a*測試樣品（ mL ）a*a*試劑一（ mL ）a*a*a*a*混勻（搖動幾下試管架）試劑二（ mL ） 1.51.51.51.5試劑三（ mL ） 1.51.51.550冰醋酸1.5（mL）旋渦混勻器混勻， 試管口用保鮮薄膜扎緊， 用

4、針頭刺一小孔， 95水浴（或用鍋開蓋煮沸 40 分鐘），取出后流水冷卻，然后 35004000轉(zhuǎn)/ 分，離心 10 分鐘，取上清 * ，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。a* 表示所取的樣品量，標(biāo)準(zhǔn)品量，無水乙醇的量、試劑一的量，四者均相等，例如樣品取 0.1mL，則標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇及試劑一也取0.1mL，若樣品取 0.2mL，則標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇及試劑一也取0.2mL。因吸光度與加樣量呈正比曲線，因而結(jié)果不受影響。* 一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白及測定空白管每批只需做12只，若測定管中蛋白量不是太高，則測定空白管可以不測， 用標(biāo)準(zhǔn)空白管來代替測定空白管。* 吸取上清比色時了

5、好用移液器吸取上清加入比色皿中，盡量避免傾倒，以免沉淀進(jìn)入比色皿，影響吸光度。注1. 用此方法，所測各管吸光度值比規(guī)范操作方法要高，但不影響最終結(jié)果。注2. 5組織勻漿 a* 取 0.10.2mL 進(jìn)行檢測較好。注3. 若發(fā)現(xiàn)檢測樣本吸光主葢低，可以將水浴時間 40 分鐘延長至80 分鐘，但您的同一課題中MDA 的檢測都必須延長至80 分鐘，以免造成批間差異。注4.此方法標(biāo)準(zhǔn)管參考吸光度：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為0.1mL 時，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度為0.1030.112。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品取樣量為 0.2mL 時，則標(biāo)準(zhǔn)管吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度為0.2060.224。計算公式1. 計算公式：（

6、）血清中 MDA 含量計算公式：血清中 MDA 含量（ nmoL/ mL)測定管吸光度測定空 白管吸光度標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ 10nmoL / mL) 樣本測試前稀釋倍數(shù)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)空 白管吸光度（）組織中 MDA 含量計算公式：組織中 MDA 含量（ nmoL / mgprot ) *測定管吸光度測定空 白管吸光度標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ 10nmoL / mL)蛋白含量（ mgprot / mL)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度標(biāo)準(zhǔn)空 白管吸光度*nmol/mgprot 為納摩爾 /毫克蛋白超氧化物歧化酶（ SOD）測試盒100 管試劑盒的組成與配制試劑一：貯備液： 10mL*1 瓶（天冷時或放冰箱會有部分結(jié)晶析出，需熱水浴

7、溶解后再用），試劑一應(yīng)用液的配制：用時每瓶加蒸餾水稀釋至 100mL，4保存。試劑二：液體 10mL*1 瓶， 4 10保存。試劑三：液體 10mL*1 瓶， 4 10保存。試劑四：液體 350L*2 支，4保存，不可冷凍； 4 號稀釋液 10mL*1 瓶， 4保存。用時二者按 1：14 稀釋，可以一次稀釋，也可以分次稀釋。配好的試劑四 4保存，不可冷凍。配好后可保存 23 個月。注：所用吸嘴最好為專用且消毒處理過。試劑五：粉劑 * 支，用時加 70 80熱雙蒸水 75mL，配好后的試劑避光 4冷藏。試劑六：粉劑 *1 支，用時加蒸餾水75mL溶解后備用，配好后的試劑避光 4冷藏保存。顯色劑的

8、配制：按照試劑五：試劑六：冰乙酸 3：3：2 的體積比配成顯色劑， 4冷藏。操作總 SOD(T-SOD)活力的測定：試劑測定管對照管試劑一（ mL ）1.01.0樣品（ mL）a*蒸餾水（ mL ）a*試劑二（ mL ）0.10.1試劑三（ mL ）0.10.1試劑四（ mL ）0.10.1用旋渦混勻器充分混勻，置37恒溫水浴 40 分鐘顯色劑（ mL ）22混勻，室溫放置 10 分鐘，于波長 550nm 處，1cm 光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。計算（一）血清總活力計算：1. 定義：每毫升反應(yīng)液中抑制率達(dá) 50時所對應(yīng)的量為一個活力單位（） 。2. 血清總 SOD 活力計算公式：對照管吸光度

9、測定管吸光度總 SOD活力（ U / mL)50 反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)對照管吸光度樣本測試前的稀釋倍數(shù)3. 計算舉例：測血清中總 SOD 的活力，取血清30L，測定對照管吸光度為0.465，測定管吸光度為0.298。將數(shù)據(jù)代入計算公式：0.4650.298（反應(yīng)液總量）T SOD活力（ U / mL)503.330.465（所取樣品量）0.0379.73U / mL（活力單位/ 毫升）（二）組織勻漿中總SOD 的活力計算：1. 定義：每毫克組織蛋白在 1mL 反應(yīng)液中 SOD 抑制率達(dá) 50時所對應(yīng)的 SOD 量為一個 SOD 活力單位（）。2. 計算公式：組織勻漿中活力（對照管吸光度測定管吸光

10、度SODU / mgprot)50對照管吸光度反應(yīng)液總體積組織中蛋白含量（ mgprot / mL)取樣量（ mL)3.計算舉例：取 1肝組織勻漿 10L 測總 SOD 的活力，對照管吸光度為 0.510，測定管的吸光度為 0.242，測得組織蛋白為 1.075mg/mL。則計算結(jié)果為：總 SOD活力（ U / m gprot)0.510 0.24250%3.311.0750.5100.01323.60U / m gprotMgprot 為毫克蛋白數(shù)總抗氧化能力的測定所需儀器設(shè)備721 或 722 分光光度計、水浴箱測試盒組成與配制：（50）試劑一：液體 60mL*2 瓶， 4保存。試劑二：粉

11、劑 *2 支，用時每支加雙蒸水至 120mL，室溫保存。試劑三：黃色貯備液 10mL*1瓶，避光冷藏保存。貯備液的稀釋液60mL*1瓶。試劑三應(yīng)用液的配制： 臨用前取貯備液以稀釋液稀釋， 比例為 1：19。需多少配多少。試劑四：溶液 24mL*1瓶，室溫保存。試劑五：溶液 24mL*1瓶，室溫保存（天冷時會凝固，每次測試前適當(dāng)加溫以加速溶解，直至透明方可使用）。簡便操作表1. 混合試劑的配制：測試前，將試劑一、二、三每種試劑所用量乘以樣本數(shù)（ n）再乘以 2（因每只測定管均需做對照管） ，然后再加上放寬的 4 只，即 n*2+4, 混合試劑的具體配制見下表：試劑名稱試劑一試劑用量（mL ） （n*2+4 ）*1試劑二（n*2+4）*2試劑三（n*2+4）*0.5將上面所有試劑按順序加在一起混勻制成混合試劑?；旌显噭┬璎F(xiàn)用現(xiàn)配。2.血清、全血簡便操作表：對照管測定管待測樣本（ mL ）a混合試劑（ mL ）3.53.5旋渦混勻器充分混勻，37水浴 30 分鐘試劑四（ mL ）0.10.1待測樣品（ mL ）a*旋渦混勻器充分混勻， 放置 10 分鐘，雙蒸水