MMTV與ClC-3轉(zhuǎn)基因鼠雜交品系的建立及鑒定-中國試驗動物學報

1、CLCN3/MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體的建立及鑒定鄧璐璐 1,李琴 3,吳慧 1,毛建文 1，徐彬 2(1,廣東藥學院基礎學院 3,廣東 廣州 510006.2, 生命科學與生物制藥學院貴州省六盤水市人民醫(yī)院貴州 六盤水 553001)廣東廣州510006.摘 要目的：建立并鑒定 CLCN3/MMTV-PyMT雙轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體， 構建氯通道 ClC-3 過表達的自發(fā)乳腺腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠模型。方法：將 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠和MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠分別進行繁殖，選取陽性子代鼠進行配對，培育雜交后代，然后通過 PCR鑒定基因型、通過組織免疫熒光方法、 Western-blot檢測轉(zhuǎn)

2、基因小鼠蛋白表達情況。結果：成功繁育 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠和 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng) PCR鑒定成功構建 CLCN3/MMTV-PyMT雙轉(zhuǎn)基因鼠雜交群體 , 并成功保種和擴群，經(jīng)組織免疫熒光和 western-blot 分析雙轉(zhuǎn)基因小鼠的 ClC-3 蛋白的表達高于MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠。 結論：成功構建 ClC-3 過表達的自發(fā)乳腺腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為進一步研究 ClC-3 在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的功能提供了良好的動物模型。關鍵詞CLCN3; MMTV-PyMT;轉(zhuǎn)基因小鼠;乳腺癌【中圖分類號】-332【文獻標識碼】A基金項目：國家自然科學基金項目（作者簡介：鄧璐璐(1989

3、-),女 ,31371144）碩士研究生，研究方向：離子通道轉(zhuǎn)化醫(yī)學。E-mail：通訊作者：徐彬。 E-mail ：metastasis . Key wordThe genotype was determined by PCR. The expression of ClC-3 in tissues was detected by immunofluorescence and western blot. Results CLCN3 and MMTV-PyMT transgenic mice were breed largely and CLCN3/MMTV-PyMT heterozygous

4、mice was establish successfully . The ClC-3 expression in CLCN3/MMTV-PyMT heterozygous mice is higher than MMTV-PyMTmice byimmunofluorescence and western blot analysisConclusion. Spontaneous breast cancer transgenicmice models with simultaneous over expression of ClC-3 were established successfully.

5、 The doubletransgenic mice provides a good animal model for further research of ClC - 3 in tumor growth andEstablishment and identification of ClC-3/MMTV-PyMT heterozygous miceDENG Lu-lu 1, LI Qin 3 ,WU Hui 1, MAO Jian-wen 1，XU Bin 2(1,School of Basic Course, Guangzhou 510006,China; 2,School of Bios

6、ciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006,China; The3, People s Hospital of Liupanshui City , Liupanshui 553001, China )AbstractObjective To establish CLCN3/MMTV-PyMTdouble transgenic mice developed breast tumors withsimultaneous over expression of ClC-3.Meth

7、od CLCN3 transgenic mice were crossed with MMTV-PyMT spontaneous mammary tumor model mice.CLCN3;MMTV-PyMT; Transgenic mice; Breast cancer離子通道如 K+, Cl - ,和 Na+ 通道的高表達促進了細胞的生長和運動，進一步促進惡性腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移 , 特別是氯離子通道在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色 1 。ClC氯通道（ ClC chloride channel ）是一類電壓門控性氯通道，目前在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)九種家族成員，其中 ClC-3 是備受

8、關注的一種。 在乳腺癌組織中、 人膠質(zhì)瘤中氯離子通道 ClC-3 的表達都明顯高于正常組織，并且不同惡性程度之間有明顯差異，提示了ClC-3 可能在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中起了重要作用 2, 3 。近年的研究報道， 細胞膜上的 ClC-3 介導了細胞的 premitotic condensation （PMC）過程，參與細胞周期調(diào)控 4, 5 。Zuo W 用氯離子通道阻斷劑 NPPB抑制 H2O2 激活的氯電流，減少 PC12細胞的凋亡，提示與容積調(diào)控相關的氯通道 ClC-3 可能參與腫瘤細胞的凋亡過程 6 。我們的研究也發(fā)現(xiàn) ClC-3 在鼻咽癌細胞中作為容積激活性氯離子通道，通過調(diào)節(jié)容積激活

9、性氯離子電流促進腫瘤細胞的遷移，且發(fā)現(xiàn)阻斷容積激活性氯離子通道以及下調(diào) ClC-3 的表達都成功抑制鼻咽癌細胞的遷移，進一步表明了 ClC-3 與腫瘤細胞遷移密切相關 7-9 。這些結果從細胞水平上提示 ClC-3 可能參與腫瘤細胞的細胞周期、 細胞凋亡和細胞遷移的調(diào)控， 但 ClC-3 在體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用尚未明確。因此，內(nèi)源性過表達 ClC-3 的轉(zhuǎn)基因小鼠為此方向的研究提供了不可替代的作用。本研究把 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠和 MMTV-PyMT自發(fā)性乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠雜交， 構建了內(nèi)源性 ClC-3 過表達的自發(fā)乳腺腫瘤小鼠模型， 為進一步研究 ClC-3 在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移特別是乳腺

10、癌生長和轉(zhuǎn)移方面的研究提供合適的動物模型。1. 材料與方法1.1實驗動物ClC-3 過表達轉(zhuǎn)基因小鼠委托 Cyagen biosciences 公司構建，編號為 TGS120401AH01質(zhì).粒名稱為，攜帶 GFP綠色熒光蛋白。 MMTV-PyMT小鼠在南京大學模式動物研究院購買， 品系為 FVB/N-Tg,634Mul/J ，2只雄性 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠， 2 只雌性野生型 FVB鼠， 15-20 周齡。 3只雄性， 5只雌性， 15-20 周齡。 SPF環(huán)境飼養(yǎng)，每天紫外 2 小時，溫度 22-28 °，濕度 40%-60%,晝夜交替。1.2實驗材料真空包裝飼料、墊料購

11、于廣中醫(yī)動物實驗中心，鼠尾試劑盒（ CW2094）購于康為世紀有限公司 , Taq 酶 (DRR037S)、 DNA Marker DL1000(D526A)、瓊脂糖購自大連寶生物工程有限公司。小鼠鑒定引物均由上海 Invitrogen 公司合成（表 1 ）。免疫染色固定液 (P0098) 、免疫染色洗滌液（ P0106），免疫染色一抗稀釋液（ P0103）、免疫染色二抗稀釋液（ P0108），免疫染色抗熒光淬滅封片液 （P0126）、Alexa Fluor488 標記山羊抗兔 IG（H+L）（A0423）、GAPDH鼠源一抗（AG019-1）均購于碧云天，ClC-3 兔源一抗 (ab2873

12、6) 購于 abcam，羊抗鼠二抗（H2311）、羊抗兔二抗 (CO211)購于 biotechnology 公司，蛋白裂解液（ K0301）購于 thermo 公司。1.3轉(zhuǎn)基因小鼠的整合檢測PCR方法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型。剪取三周齡小鼠尾尖，采用鼠尾DNA提取試劑盒提取基因組 DNA，利用 MMTV-PyMT和 ClC-3 特異性引物 ( 如下表 ) 進行 PCR擴增。 PCR體系分別加入PCR Mix酶 25ul,PCR 引物各 1ul ，模板 DNA 1ug， ddH2O加到 50ul 。反應條件為： 94°預變性3min，94°變性 30s，退火 64°

13、 1min，延伸 72°1min，循環(huán) 35 次， 72°延伸 2min，4°保存。取 10ulPCR產(chǎn)物進行 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結果。表（ 1） 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定引物序列Table 1 The primer sequences specific for the identificationof transgenic miceGenesupstream primer(5 -3 )downstream primer(5 -3 )Product sizeMMTV/PyMTGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGGAAAGTCACTAGGAGC

14、AGGG 556bpCLCN3TTGCCTACTATCACCACGACGCATCTCCAACCCATTTACT440bp內(nèi)參CAAATGTTGCTTGCTTGTCTGGTGGTCAGTCGAGTGCACAGTTT200bp1.4組織免疫熒光檢測：石蠟切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水浸泡2 次，每次 5min，微波抗原修復，單蒸水洗 3 次，每次 5min。滴加 3% H2 O2，室溫孵育 15 min ，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min 。滴加即用型 5%BSA封閉液，室溫孵育 40min，棄去封閉液。滴加 ClC-3 抗體（ 1:100 稀釋），濕盒內(nèi) 4°過夜。復溫 40min，PBS

15、洗 3 次，每次 5min，滴加 CY3-抗兔 / 鼠 IgG 二抗，室溫孵育 1h，PBS洗 5 次每次 5min，再加入 DAPI 復染核， PBS洗 5 次，每次 5min。滴加抗熒光猝滅劑封片液，封片，自然晾干。1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體的構建：選取 2-3 月齡 MMTV-PyMT雄性小鼠和 CLCN3雌性轉(zhuǎn)基因小鼠進行配對，喂食高壓滅菌過的生瓜子，記錄其分娩時間。其生育的為F1 代雜交鼠，待 3 周后剪鼠尾提取 DNA,PCR鑒定基因型，其中有 MMTV-PyMT和 CLCN3雙轉(zhuǎn)陽性小鼠、 MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)基因陽性小鼠， 也有 CLCN3單轉(zhuǎn)陽性小鼠。 再選取同窩 MMTV

16、-PyMT陽性雄性小鼠和 CLCN3陽性雌性轉(zhuǎn)基因小鼠同胞兄妹交配，擴大種群。1.6 蛋白印跡分析：分別通過組織勻漿提取同窩MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)基因鼠和MMTV/CLCN3雙轉(zhuǎn)基因鼠、陰性對照小鼠的肺組織蛋白，然后進行10%的十二烷基磺酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠（ SDS-PAGE）電泳，積層膠 70V 30min，分離膠 120V 90min，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上，350mA90min，轉(zhuǎn)膜結束用 5%脫脂奶粉封閉 2h。沿 Marker70KD處剪開，大于 70KD分子量加入ClC-3 抗體（ 1:1000 稀釋），小于 70KD分子量的加入 GAPDH單克隆抗體（ 1:1000

17、稀釋）， 4° 孵育過夜，回收一抗， TBST洗 5 次每次 5min，分別加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗，室溫孵育 1h，回收二抗， TBST洗膜 5 次每次 5min，加入發(fā)光液，膠片顯影曝光。1.7 統(tǒng)計方法：實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（ X ± s）表示。兩組數(shù)據(jù)之間的差異用Student s t檢驗，以P 0.05 為差異顯著。2. 結果2.1 MMTV 與 CLCN3轉(zhuǎn)基因鼠的培育與鑒定首先用引種的 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因雄鼠和 FVB雌鼠進行 1:1 比例配對（ F0 代），其生育的小鼠為 F1 代幼鼠， 3 周后剪取鼠尾提取 DNA，經(jīng)過

18、加入特異性引物 PCR擴增目的基因片段， 瓊脂糖凝膠電泳， 凝膠成像，準確檢測到子代陽性轉(zhuǎn)基因鼠， 再選取同窩子代陽性雄鼠和陰性雌鼠進行同胞交配，擴大種群。至今共育子代 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠共 50 多只。 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠用同樣的方法也進行全同胞交配，至今共培育子代80 多只。 MMTV-PyMT陽性小鼠在 556bp處有明顯條帶， CLCN3陽性小鼠在 440bp 處出現(xiàn)條帶， 200bp 為內(nèi)參基因，部分結果如圖1：注： 1-7 ： MMTV-PyMT引物（ 556bp）。 8-11 ：檢測 CLCN3引物（ 440bp）圖 1 MMTV-PyMT和 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒

19、定Note:1-7:identification of MMTV-PyMT:556bp； 8-11 ：identification of CLCN3:440bpFigure 1 Identification of MMTV-PyMT和 CLCN3 mice2.2 CLCN3 轉(zhuǎn)基因小鼠蛋白表達免疫熒光分析CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠構建質(zhì)粒為，為了驗證CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠是否表達ClC-3 蛋白，選取同窩 CLCN3單轉(zhuǎn)陽性小鼠和雙陰性小鼠處死解剖，取肺，制作石蠟切片，進行組織免疫熒光分析，由于其質(zhì)粒中攜帶 GFP基因，所以在構建成功的前提下組織中表達綠色熒光蛋白。結果發(fā)現(xiàn) CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠在肺組

20、織中（圖 2A）明顯表達 ClC-3 蛋白和綠色熒光蛋白，而同窩陰性小鼠肺組織（圖 2B）中僅見支氣管上皮細胞少量表達 ClC-3 。注： A：CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠的肺組織B：野生型小鼠的肺組織圖 2CLCN3 轉(zhuǎn)基因鼠肺組織的ClC-3 蛋白表達Note:A ： ClC-3 transgenic miceB: wild type miceFigure 2 Immunofluorescence analysis of the ClC-3 expression in lungs2.3 MMTV-PyMT與 CLCN3轉(zhuǎn)基因鼠雜交群體的建立選取 2-3 月齡 MMTV-PyMT陽性雄鼠和 CLCN

21、3陽性雌鼠配對（雜交圖譜如圖3）， 8 周后產(chǎn)仔 8-12 只，剪取鼠尾提取基因組 DNA進行 PCR擴增鑒定，若同一只老鼠 MMTV-PyMT和 CLCN3 分別都出現(xiàn)條帶，則為雙轉(zhuǎn)基因鼠陽性鼠 ( 圖 1) 。共育 MMTV-PyMT和 CLCN3雙轉(zhuǎn)基因雜交子代小鼠約 100 多只。圖 3 MMTV-PyMT與 CLCN3轉(zhuǎn)基因小鼠雜交群體建立示意圖Figure 3 The establishment of MMTV-PyMT和 CLCN3 hybrid strain2.4 ClC-3蛋白的組織器官的表達分析為了驗證高度轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤和ClC-3 蛋白表達之間的關聯(lián)，選取同一胎的CLCN

22、3單轉(zhuǎn)陽性小鼠、 MMTV-PyMT /CLCN3雙轉(zhuǎn)陽性小鼠和雙陰性小鼠的肺組織，采用組織勻漿法提取蛋白， western-blot 方法檢測 ClC-3 蛋白表達水平。結果顯示 MMTV-PyMT/CLCN3雙轉(zhuǎn)陽性小鼠的 ClC-3 蛋白含量明顯高于同窩的 MMTV-PyMT單轉(zhuǎn)陽性小鼠（圖 4）。圖 4ClC-3在小鼠肺中的表達Figure 4 Western blot analysis of the ClC-3 expression in lungs3. 討論ClC-3屬于 ClC家族中的一員，推薦名為H+Cl - exchange transporter 3,基因符號為 CLCN3

23、。ClC-3 通道蛋白有 13個跨膜區(qū)域， N和C末端均位于細胞內(nèi)，其有短型和長型之分，短型 ClC-3 蛋白由 760個氨基酸構成，在短型 ClC-3 蛋白氨基末端 (N端) 加上 58個氨基酸殘基即構成長型 ClC-3 通道蛋白。廣泛分布于腦、腎、肝、骨骼肌、心臟、腎上腺和胰腺等組織。 Jentsch TJ和suzuki M表明 ClC-3 可能作為容積激活性氯離子通道參與調(diào)節(jié)性細胞容積回縮（ RVD）的調(diào)節(jié) 10, 11 。 RVD被認為是與細胞的增殖、分化、遷移及細胞的凋亡密切相關的生理功能之一。多項研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中， ClC-3 可通過調(diào)節(jié)容積激活性氯離子電流和 RVD調(diào)控細胞

24、的增殖和遷移過程 12-15 。提示 ClC-3 在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中有重要的作用。轉(zhuǎn)基因動物技術的發(fā)展有 30余年的歷史。該技術是把目的基因轉(zhuǎn)入早期胚胎細胞 , 使之能夠整合到染色體上 , 并且傳遞給子代 , 這樣獲得的動物叫轉(zhuǎn)基因動物 16 。轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)廣泛應用于生命科學、醫(yī)藥基礎研究等領域。本研究所應用的ClC-3 高表達轉(zhuǎn)基因小鼠采用Gateway技術把目的基因 CLCN3克隆到入門載體，不再依賴限制性內(nèi)切酶而靠載體上存在的特定充足位點和重組酶，高效、快速地把CLCN3克隆到目的載體中。該技術是一種通用性的克隆方法，簡單便捷，用于基因的蛋白質(zhì)表達和功能分析17 。 ClC-3 高表

25、達轉(zhuǎn)基因小鼠質(zhì)粒名稱為，穩(wěn)定克隆到目的載體上，通過胚胎顯微注射法得到穩(wěn)定遺傳且高度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)鼠尾提取基因組 DNA、再PCR擴增目的片段， 準確快速的檢測到 CLCN3基因高表達， 而且在繁殖的后代中也穩(wěn)定遺傳。因為在質(zhì)粒中攜帶 GFP基因，所以組織中表達綠色熒光蛋白， 所以采用組織免疫熒光的方法對肺組織進行切片觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性所攜帶的綠色熒光蛋白和ClC-3 蛋白表達完全一致，表明CLCN3過表達轉(zhuǎn)基因小鼠構建成功。MMTV-PyMT自發(fā)乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠來源于南京大學模式生物研究所，該小鼠9周自發(fā)乳腺腫瘤， 12周后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。本研究成功構建了ClC-3 高表達的自發(fā)乳腺腫瘤小鼠模型

26、，通過PCR技術和組織免疫熒光、Westernblot 方法準確進行鑒定，從基因表達水平和組織蛋白表達水平證實所得雜交小鼠成功整合CLCN3和 MMTV-PyVT基因，并成功表達 ClC-3 蛋白，到目前為止培育雜交子代小鼠共 100多只。該小鼠模型的成功構建為進一步研究ClC-3 在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面的作用提供了良好的實驗基礎，同時也為研究ClC-3 高表達對其他組織器官生理病理的影響提供實驗材料基礎。參考文獻 :1.Cuddapah VA,Sontheimer H.Ion channels and transporters corrected in cancer. 2.Ion channe

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