昆蟲細(xì)胞省略的無血清培養(yǎng)及其特性研究

1、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 26(2):131 135, 2009JornalofQingdaoAgricltralUniversity(NatralScience)文章編號(hào):1674 148X(2009)02 0131 05昆蟲細(xì)胞 BTI-Tn-5B1 -4和 Sf-9的無血清培養(yǎng)及其特性研究, 馬明,勛(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)無脊椎動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞工程中心, 山東 青島 266 09)摘要:本研究對(duì)目前應(yīng)用最多的兩種昆蟲細(xì)胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在無血清培養(yǎng)基 Sf 900 中進(jìn)行馴化和培養(yǎng), 現(xiàn)已傳至 45代以上。 比較了兩種細(xì)胞在 Sf 900 和有血清培養(yǎng)基 TNM F

2、H中的細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)量和重組蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果表明, 在 Sf 900 中 Sf 9細(xì)胞比 TNM FH培養(yǎng)的略大, BTI Tn 5B14的圓形細(xì)胞增多, BTI Tn 5B1 4和 Sf 9在 Sf 900 中生長(zhǎng)速度快, 群體倍增時(shí)間分別為 18.5h和 21.7h,而在 TNM FH中, BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時(shí)間分別為 21.9h和 25.4h;在兩種培養(yǎng)基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細(xì)胞的率、多角體產(chǎn)量和 半乳糖苷酶(galactosidase)的表達(dá)水平均無明顯差異, 而堿性磷酸酶(secretedalkalinephosphatase,

3、 SEAP)在 Sf 900 中的表達(dá)水平明顯高于 TNM FH中的水平 。:昆蟲細(xì)胞;無血清培養(yǎng);生長(zhǎng)曲線;號(hào):Q813.1 1產(chǎn)量;蛋白表達(dá)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AStudyonCharacteristicsofBTI-Tn-5B1 -4 andSf-9 CelsAdaptedinSerum -MediumLIYinhua, ZHENGGuiling, LIChangyou, MALIGuoxun(ACenterforAdvancedInvertebrateCelCultureandCelEnginering, QAU, Qingdao266 09,Abstract:BTI Tn 5B14 andS

4、f 9 cellines, thataredominantce lineswithbasicstudyandaplicationintheworld, wptedtoaserummedium, Sf 900 foraproximately45 pasages.Thecharacteristicsproductionandrecombinantproteinexpresionwerecomparedwith FH.TheresultsshowedthatthetwocelslineinSf 900 werelitleincludingmorphology, growthkinetics,that

5、oftheygrewinSf 900 andTNMbigerthaninTNM FH.ThecelpopulationdoublingtimesofbothBTI Tn5B14 andSf 9 celsinSf 900(18.5 and21.7 h, respectively)shortenedincomprisiontothatinTNM FH(21.9 hforBTI Tn5B14 and25.4 hforSf 9).Theinfectionrate, productionofpolyhedraandexpresionofgalactosidase(gal)inbothtypesofmed

6、iawerenotsignificantlydiferent, butheexpresionofsecretedalkalinephosphatase(SEAP)inSf 900 mediumwashigherthaninserum containingcultures.Keywords:ce lines;serumculture;growthkinetics;production;proteinexpresion自 1962年 Grace蟲細(xì)胞系以來, 已經(jīng)從當(dāng)有吸引力的新途徑, 因此, 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)已在生物學(xué)、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用 。目前建立了世界上第一個(gè)昆100多種昆蟲建立了

7、5001多株細(xì)胞系, 昆蟲細(xì)胞可以作為載體生產(chǎn)生物,是在含有昂貴胎牛血清 (fetalbovum, FBS)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的建立, 為培養(yǎng)基中培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞, 高成本限制了大規(guī)模培養(yǎng)另外由于桿狀技術(shù)的發(fā)展, 而且血清的生產(chǎn)許多具有重要生物學(xué)價(jià)值的重組蛋白提供了相還會(huì)給基因工程表達(dá)收稿日期:200828基金項(xiàng)目: 作者簡(jiǎn)介:通訊作者:自然科學(xué)基金(3077 45 )973計(jì)劃(2009CB8902)( 983 ), 女, 山東泰安人, 在讀, 研究方向:昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)。勛,gxli青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)26卷132產(chǎn)物的后處理帶來。此外, 血清還是支原體和細(xì)胞形態(tài)觀察和大小的測(cè)量 :在不

8、同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞, 28條件下培養(yǎng) , 在 OlympusIX71 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照, 隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞, 通過顯微標(biāo)尺測(cè)量細(xì)胞的大小。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞 , 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后, 用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋到 25210 cels/ml的濃度 , 加到 25cm 培養(yǎng)瓶中, 每瓶5ml, 28條件下培養(yǎng)。每天取 3 瓶細(xì)胞, 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù), 計(jì)算細(xì)胞的平均濃度, 繪出細(xì)胞生長(zhǎng)曲污染的重要來源。無血清培養(yǎng)基的優(yōu)其它點(diǎn)在于化學(xué)成分明確, 培養(yǎng)條件容易, 減少了不同批次培養(yǎng)基之間在數(shù)量和質(zhì)量上的差異, 除去了微生物污染的潛在來源, 利于細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的分離等操作

9、。因此發(fā)展昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基一直是細(xì)胞培養(yǎng)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn) 。目前世界上應(yīng)用最多的 細(xì) 胞 系 主要 是 來 源 于 草 地 貪 夜蛾(Spodopterafrugiperda)的 Sf 21或其克隆株 Sf2, 39和粉紋夜蛾 (Trichoplusiani)的 BTI Tn5B1線, 并按 Hayflick等時(shí)間。侵染和 產(chǎn)量的測(cè)定 :取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞, 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后, 按 1.0 105 cels/孔的量接入 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 3次重復(fù);28培養(yǎng) 2h, 吸的計(jì)算細(xì)胞群體倍增4(HIGHFIVE), 本文對(duì) Sf 9和 BTI Tn5B14進(jìn)行無血清培養(yǎng)和馴化, 并研究在無

10、血清培養(yǎng)條件下細(xì)胞的生物學(xué)特性, 為重組蛋白和量生產(chǎn)提供理論依據(jù)和有效途徑。1 材料和1.1 材料殺蟲劑的大去培養(yǎng)基, 每孔加入 AcMNPV 1A復(fù)數(shù)MOI=10), 吸附 1h后棄去液, 每孔加入 1ml新鮮培養(yǎng)基, 28培養(yǎng)并觀察, 120h后檢查侵染細(xì)胞系 :BTI Tn5B14(HIGHFIVE)細(xì)胞系 ,結(jié)果,多角體 (OB)產(chǎn)量的測(cè)定參照 Wang。5 的康奈爾大學(xué) Granados博士惠贈(zèng) ;Sf 9細(xì)胞康奈爾大學(xué) Blisard博士惠贈(zèng)。由系, 由等堿性磷酸酶 (SEAP)和 半乳糖苷酶 ( gal)的表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 按 1.0105 cels/孔的量接入 24孔板

11、中, 28培養(yǎng) 2h, 吸去培養(yǎng)基,:苜蓿銀紋夜蛾核型多角體昆蟲(AutographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisAcMNPV)AcMNPV 1A株以及重組Ac康A(chǔ)cMNPV SEAP和 AcMNPV gal將重組MNPV SEAP和 AcMNPV 奈爾大學(xué) Granados博士惠贈(zèng) 。gal等, 均由按復(fù)數(shù) MOI=10 的比例細(xì)胞, 吸附 1h后棄去液, 每孔加入 1ml新鮮培養(yǎng)基 , 28條件下67的培養(yǎng)基 :有血清培養(yǎng)基為 TNM FH昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基, 由 Grace細(xì)胞培養(yǎng)基 (GIBCO)改進(jìn)并輔以 10%胎牛血清 (MD genic

12、s公司 ), 無血清培養(yǎng)基為 Sf 900 SFM昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO)。1.2細(xì)胞的傳代培養(yǎng) :待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿 25cm2 培養(yǎng)瓶 (Corning公司 )瓶底 , 在超凈工作臺(tái)中用吸管輕輕吹打貼壁細(xì)胞, 制成細(xì)胞懸液, 取 1ml細(xì)胞并加入 4ml新鮮培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中, 置于 28 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng), 每隔 3 4d傳代 1次。細(xì)胞的無血清培養(yǎng)和馴化 :將在含 10%胎牛血培養(yǎng), 按 Davis等 和 Zheng等蛋白的表達(dá)。2 結(jié)果與分析2.1 細(xì)胞的無血清培養(yǎng)和馴化, 測(cè)定重組兩種細(xì)胞從含 10%FBS的 TNM FH培養(yǎng)基分別經(jīng)過含 8%、5%、3%和 1%FBS的 Sf 90

13、0 SFM培養(yǎng)基, 最后到 Sf 900 SFM無血清培養(yǎng)基的適應(yīng)過程中, BTI Tn5B1 4的馴化過程較慢, 細(xì)胞在含 8%和 5%FBS的培養(yǎng)基中 , 培養(yǎng)的第 1胞表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢, 部分細(xì)胞懸浮破碎, 需及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基, 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)進(jìn)行傳代,傳代 3次后, 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在轉(zhuǎn)到含 3%FBS的培養(yǎng)基時(shí), 細(xì)胞比在 TNM FH培養(yǎng)基中的略大, 生長(zhǎng)緩慢且率高, 馴化過程較長(zhǎng), 培養(yǎng) 10細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸。繼續(xù)馴化到含 1%FBS的培養(yǎng)基, 直至 Sf 900 SFM中 , 最初培養(yǎng)的 1 2胞生長(zhǎng)均較緩慢, 當(dāng)適應(yīng)后生長(zhǎng)速率則明顯加快, 平清的 TNM FH培養(yǎng)基中

14、生長(zhǎng)的 BTI Tn5B14和 Sf 9細(xì)胞, 按細(xì)胞的傳代培養(yǎng), 分別依次傳代于含 8%、 5%、 3%、 1% FBS的 Sf 900SFM培養(yǎng)基中 , 在每種 FBS濃度的培養(yǎng)基中適應(yīng)并傳 3, 再于下一個(gè) FBS濃度的培養(yǎng)基中能培養(yǎng), 直至在完全無血清培養(yǎng)基 Sf 900 SFM中適應(yīng)并傳代。2期, 等:昆蟲細(xì)胞 BTI Tn 5B14和 Sf 9的無血清培養(yǎng)及其特性研究133均每 3d正常傳 1代, 整個(gè)馴化過程用了 42.85m Tn5B118.592.40m;而在TNM FH中 BTI的時(shí)間。與 BTI Tn5B14相比, Sf 9的適應(yīng)較快, 大約經(jīng)歷 45d的時(shí)間就能夠在 S

15、f 900 SFM中生長(zhǎng)并正常傳代培養(yǎng)。目前 BTI Tn5B14 和 Sf 9已在無血清培養(yǎng)基中分別傳代 45代和 48代。2.2 細(xì)胞的形態(tài)比較BTI Tn5B14 和 Sf 9 兩種細(xì)胞在 TNMFH和 Sf 900 SFM培養(yǎng)基中的形態(tài)見圖 1。在 Sf 900 SFM中, BTI Tn5B14 細(xì)胞變得短而粗,而且圓形細(xì)胞增多, 大約占 37.3%, 直徑為 19.644 圓形細(xì)胞的比例約為 10.0%, 直徑為16.563.01m, 梭形細(xì)胞占大多數(shù), 約占 90.0%,大小為 52.164.52m 15.542.30m。 Sf 9細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中均為圓形, 在 Sf 900 S

16、FM中略微變大, 細(xì)胞直徑為 16.19TNM FH中為 14.742.03m。1.37m, 而在2.3 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與群體倍增時(shí)間BTI Tn5B14和 Sf 9在 Sf 900 SFM中連續(xù)傳代 20代以后 , 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速 , 狀態(tài)良好 。2.65m, 梭形細(xì)胞約占62.7%, 大小為36.42細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見圖 2。在 Sf 900SFM中, BTI圖 1 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中的形態(tài)A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 細(xì)胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4細(xì)胞;C.TNM FH中的 Sf 9細(xì)胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf

17、 9細(xì)胞圖 2 兩種細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線A.BTI Tn5B 4 細(xì)胞;B.Sf 9 細(xì)胞青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)26卷1346Tn5B14細(xì)胞最高密度可達(dá) 2.3410 cels/ml, Sf 9細(xì)胞最高密度可達(dá) 2.7510 cels/ml。在 Sf900 SFM中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時(shí)間分別為 18.5h和 21.7h, 均比在 TNM FH中生長(zhǎng)速度快, 在 TNM FH中 , BTI Tn5B1 4和 Sf 9的群體倍增時(shí)間分別為 21.9h和 25.4h。3。 BTI Tn5B14和 Sf 9細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中6對(duì) AcMNPV均比較敏感

18、,率均在 90%以上。BTI Tn5B1 4 細(xì)胞在 Sf 900 SFM和 TNMFH中的多角體產(chǎn)量分別為 81.73 和 80.15 OBs/ cel, 二者差異不顯著, 但均顯著高于 Sf 9 細(xì)胞的多角體產(chǎn)量。 Sf 9細(xì)胞在 Sf 900 SFM和 TNM2.4FH中的多角體產(chǎn)量分別為cel, 差異也不顯著。31.95和29.96 OBs/的侵染和產(chǎn)量侵染和多角體產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果見附表和圖圖 3 AcMNPV對(duì)兩種培養(yǎng)基中 BTI Tn5B1 4和 Sf 9細(xì)胞的侵染A.TNM FH中的 BTI Tn5B 4 細(xì)胞;B.Sf 900 SFM中的 BTI Tn5B4細(xì)胞;C.TNM FH中

19、的 Sf 9細(xì)胞;D.Sf 900 SFM中的 Sf 9細(xì)胞兩種培養(yǎng)基中 BTI Tn5B14和 Sf 9細(xì)胞的侵染率和產(chǎn)量比較4在 Sf 900 SFM和 TNMFH兩種培養(yǎng)基中附表的 半乳糖苷酶( gal)表達(dá)量在第 8 d達(dá)到最高, 分別為 1.86 10 IU/ml和 1.54 10 IU/ml, 差異不顯著 ;Sf 9細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中的表達(dá)量在第 8 d也達(dá)到最高, 分別為 0.88 10 IU/ml和 0.6210 IU/ml, 差異也不顯著。而 BTI Tn5B14 在 Sf900 SFM中堿性磷酸酶 (SEAP)的表達(dá)水平較TNM FH中有顯著提高 , 第 7d的表達(dá)量分別為

20、3.90 IU/ml和 2.28 IU/ml;Sf 9在 Sf 900 SFM中 SEAP的表達(dá)量也較 TNM FH中高, 第 7 d的表達(dá)量分別為 0.69 IU/ml和 0.41 IU/ml。從圖 4 還可看出, BTI Tn5B14細(xì)胞表達(dá)兩種重組蛋白的水平均較 Sf 9高, 大約是 Sf 9表達(dá)量的 2 5倍。侵染率(%)多角體產(chǎn)量(OBscel)細(xì)胞培養(yǎng)基BTI Tn5B4TNM FH Sf 900 SFMTNM FH97.594.294.692.380. 5 8 .73 29.963 .952.35 A.52 A.38 B2.24 BSf 9Sf 900 SFM注:相同字母表示差異

21、不顯著(P<0.0 )。2.5半乳糖苷酶 (gal)和堿性磷酸酶(SEAP)的表達(dá)重組蛋白的表達(dá)結(jié)果 (圖4)可見, BTI Tn5B12期, 等:昆蟲細(xì)胞 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9的無血清培養(yǎng)及其特性研究135圖 4BTI Tn5B14和 Sf 9細(xì)胞在兩種培養(yǎng)基中重組蛋白的表達(dá)水平A. 半乳糖苷酶( gal)的表達(dá);B.堿性磷酸酶(SEAP)的表達(dá)良好基礎(chǔ)。3討論參考文獻(xiàn):昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)在大量生產(chǎn)殺蟲劑 GranadosRR, LiGX, BlisardGW.Insectcelcultureandbio-technology J .VirologicaSinica,

22、 2007, 22(2):83 93.和表達(dá)重組蛋白方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景, 有研究者對(duì)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)進(jìn)行了一些嘗試和 2,萌.昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng) J .細(xì)胞生物5, 8 10, 為大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)奠定了理論基研究學(xué)雜志, 2005, 27(2): 27 32.TaticekRA, ChoiC, PhanSE, etal.Comparisonofgrowthand recombinantproteinexpresionintwodiferentinsectce linesinat- tachedandsuspensionculture J .BiotechnolProg, 200

23、, 7(4):676 684.HayflickL.Theoryofpopulationincreasebysubcultivation.Tisue culturemethodsandaplication.(eds, KrusePF, PatersonM K) M .AcademicPres, NY. 973, 222 223.礎(chǔ)。本文通過對(duì)目前國(guó)際上應(yīng)用最多的 BTI Tn 5B1 4和 Sf 9 細(xì)胞系進(jìn)行無血清培養(yǎng)馴化和生物學(xué)特性比較, 發(fā)現(xiàn) Sf 900 SFM無血清培養(yǎng)基可以提供以上兩種細(xì)胞快速生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng), 并實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量的 增殖和高水平的蛋白表達(dá), 為昆蟲細(xì)胞在無血清條件下的大規(guī)模

24、培養(yǎng)提供有效的途徑。 3 4 5WangP, GranadosRR, ShulerM L.Studiesonserumcul-tureofinsectcelsforpropagationandrecombinantproteinpro-無血清培養(yǎng)是今后昆蟲細(xì)胞的必然趨duction J .Invertebr.Pathol., 992, 59:46 53. DavisTR, TroterKM, GranadosRR, etal.Bacul勢(shì), 目前商業(yè)化生產(chǎn)的無血清培養(yǎng)基通常有很高的細(xì)胞特異性, Sf 900 SFM是一種適用于 Sf 9和Sf 21等細(xì)胞系的無血清培養(yǎng)基, 因此, Sf 9 細(xì)胞 6expres-sionofalkalinephosphataseasareportergeneforevaluationofpro-duction, glycosylationandsecretion J .BioTechnology,992,0: 4850.在其中的適應(yīng)較快, 而 BTI Tn 5B14細(xì)胞的適 7ZhengGL, LiCY, LiGX, etal.Constructionandcharacteris-t