酵母單雜交 實(shí)驗(yàn)步驟總結(jié)

1、1 pBait-AbAi載體的構(gòu)建（酵母報(bào)道子的構(gòu)建）注：酵母報(bào)道子（pBait-AbAi）包含目的順式作用元件的一個或多個拷貝，且插入到pAbAi載體AbAir報(bào)告基因的上游。大量研究表明最有效的構(gòu)建應(yīng)包含目的DNA三個以上的首尾連接的拷貝。首尾連接的拷貝產(chǎn)生方式很多，但對于長度小于20 bp的調(diào)控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途徑。（1） 設(shè)計(jì)并合成包含目的序列的兩條反向平行的寡核苷酸序列，且兩端加上與pAbAi載體酶切產(chǎn)物一致的粘性末端（建議合成一個目的序列的突變序列作為對照，以排除可能的假陽性）。（2） 用TE buffer溶解寡核苷酸至終濃度100 mmol/L。（3） 將正向

2、鏈和反向鏈按照1:1的比例混合（退火后的雙鏈寡核苷酸最大濃度為50 mmol/L）。（4） 95 °C保溫30 s，去除二級結(jié)構(gòu)。（5） 72 °C保溫2 min，37 °C保溫2 min，25 °C保溫2min。注：緩慢退火，有助于雙鏈寡核苷酸的形成。（6） 冰上放置。退火后的產(chǎn)物可貯存在-20 °C冰箱備用。（7） 酶切1 mL pAbAi載體，用凝膠回收純化或柱純化的方式純化酶切產(chǎn)物。注：回收前，可用瓊脂糖凝膠檢測是否酶切完全。（8） 將退火后的寡核苷酸稀釋100倍至終濃度為0.5 mmol/L。（9） 在連接反應(yīng)管中加入如下成分：pAb

3、Ai載體（50 ng/mL） 1.0 mLannealed oligonucleotide （0.5 mmol/L） 1.0 mL10×T4 DNA ligase buffer 1.5 mLBSA（10 mg/mL） 0.5 mLNuclease-free H2O 10.5 mLT4 DNA ligase （400 U/mL） 0.5 mL總體積 15 mL 注：如果有必要，可用1 mL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作為陰性對照。（10） 將反應(yīng)體系室溫放置連接3 h，轉(zhuǎn)化E coli，采用常規(guī)方法檢測陽性克隆。注：可用酶切或測序進(jìn)行檢測。2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，生成

4、Bait-Reporter酵母菌株（圖）圖3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意圖（1） 用BstB I或者Bbs I酶切2 mL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi質(zhì)粒，使其在URA3基因處斷開，純化酶切產(chǎn)物。（2） 按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步驟用1 ml酶切后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母。（3） 稀釋每個轉(zhuǎn)化體系至1/10、1/100、1/1000，分別取每個稀釋物均勻涂于SD/-Ura瓊脂平板上。3 d后挑取5個單克隆，用Matchmaker Insert Check PCR Mix1進(jìn)

5、行PCR檢測陽性克隆，用Y1HGold的單克隆做陰性對照。（4） 在PCR管中加25 ml PCR-grade H2O。（5） 用干凈的槍頭輕輕接觸酵母單克隆，以獲得非常少量的酵母細(xì)胞。將槍頭伸進(jìn)PCR-grade H2O中攪拌，使酵母細(xì)胞散開。注：切忌挑取整個酵母單克隆，因?yàn)榧?xì)胞過多會阻止PCR反應(yīng)的進(jìn)行。如果加入細(xì)胞后水變渾濁，證明加入了過多的酵母細(xì)胞。（6） 向每個管中加入25 ml Matchmaker Insert Check PCR Mix，混勻，離心。每個PCR管中現(xiàn)已含有如下反應(yīng)物：Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 mlH2O/yeast 2

6、5 ml總體積 50 ml（7） 按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)；95 °C 1 min98 °C 10 s55 °C 30 s 30 cycles68 °C 2 min（8） 取5 ml PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。注：引物與AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因組結(jié)合，擴(kuò)增片段長約1.4 kb。圖4 PCR檢測pBait-AbAi的插入情況正確的PCR檢測結(jié)果應(yīng)是：陽性對照：1.4 kb陰性對照：無條帶誘餌菌株：1.35 kb+insert size（9） 分別挑取PCR檢測呈陽性的誘餌克隆和p53-AbAi對照克隆，在SD/-Ura平

7、板上劃線培養(yǎng)。30 °C孵育3 d后，將平板置于4 °C保存，即為新構(gòu)建的Y1HGoldBait/AbAi菌株和p53/AbAi對照菌株。（10） 經(jīng)過長期放置后，挑取單克隆在YPDA液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用 1 mL預(yù)冷培養(yǎng)基（100 ml滅菌的YPDA與50 ml滅菌的75%甘油混合）重懸菌體，速凍后與-70 °C保存。3 檢測誘餌菌株AbAr基因的表達(dá) 在不存在捕獲物的情況下，由于克隆到pAbAi載體中的誘餌序列不同，誘餌菌株報(bào)告基因的本底表達(dá)水平也不相同。例如：p53-AbAi對照的最低aureobasidin A抑制濃度為100 ng/ml

8、。注：酵母單雜交實(shí)驗(yàn)成功的前提是沒有內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子能夠與目的序列結(jié)合或者結(jié)合能力非常弱。因此在進(jìn)行文庫篩選之前，檢測所構(gòu)建的誘餌菌株AbAr基因的表達(dá)情況十分重要。所以需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定進(jìn)行文庫篩選時抑制誘餌菌株報(bào)告基因本底表達(dá)所需的AbA濃度。（1） 分別挑取誘餌克隆和對照克隆，用0.9% NaCl重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)A600到0.002（大約2000個細(xì)胞/100 ml）。（2） 在下述培養(yǎng)基上分別涂布100 ml重懸后的菌液，30 °C培養(yǎng)2-3 d。SD/-UraSD/-Ura with AbA （100 ng/mL）SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）SD/-U

9、ra with AbA （200 ng/mL）預(yù)期結(jié)果如下所示：表1 AbAr基因預(yù)期本底表達(dá)結(jié)果AbA/（ng/mL）Y1HGoldp53-AbAi克隆數(shù)Y1HGoldpBait-AbAi克隆數(shù)0約2000約20001000Bait dependent1500Bait dependent2000Bait dependent（3） 在進(jìn)行文庫篩選時，使用AbA的濃度應(yīng)為最低抑制濃度，或使用比最低抑制濃度稍高的AbA濃度（高約50-100 ng/mL），以徹底抑制誘餌菌株的生長。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表達(dá)，可以嘗試提高AbA濃度至500-1000 ng/mL。然而，在不存

10、在捕獲物的情況下，如果1000 ng/mL的AbA濃度仍無法抑制AbAr基因的表達(dá)，那么很可能存在能夠識別并與目的序列結(jié)合的內(nèi)源調(diào)控因子，因而該目的序列無法用來進(jìn)行酵母單雜交篩選。4 文庫cDNA的合成提取試材總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。合成的cDNA末端具有與pGADT7-Rec相同的酶切位點(diǎn)。（1） cDNA第一鏈的合成準(zhǔn)備高質(zhì)量的poly A和/或總RNA，用human placenta poly A+RNA作為陽性對照。注：RNA的質(zhì)量決定文庫的質(zhì)量，RNA應(yīng)為所要研究的特定時期和特定組織的RNA。在微量離心管中加入如下反應(yīng)物： RNA模板（0.025-1.0 mg poly A

11、和/或0.10-2.0 mg總RNA） 1-2 ml CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（random）引物 1.0 ml Deionized H2O （使總體積達(dá)到4.0 ml） 1-2 ml 總體積 4.0 ml 在另外一支管中加入對照cDNA反應(yīng)物，即RNA使用1 ml（1 mg）control poly A+RNA。72 °C孵育2 min。冰上放置2 min，輕輕混勻，立即加入步驟中的試劑。每一個反應(yīng)加入如下試劑，輕輕混勻離心。 5×first-strand buffer 2.0 ml DTT（100 mmol/L） 1.0 ml dNTP

12、 mixture（10 mmol/L） 1.0 ml SMART M-MLV RT 1.0 ml 總體積 5.0 ml注：步驟中的試劑可在步驟之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始關(guān)鍵步驟，變性后的RNA/引物mix冰上放置的時間不應(yīng)超過2 min。如果用的是CDS III/6隨機(jī)引物，25-30 °C保溫10 min。如果用的是CDS III引物，省略此步，進(jìn)行步驟。42 °C保溫10 min。加入1 ml SMART III oligo，充分混合，42 °C保溫1 h。75 °C保溫10 min終止第一鏈的合成。降至室溫，加入1 ml RNase

13、 H（2 U）。11 37 °C保溫20 min。12 cDNA第一鏈合成產(chǎn)物應(yīng)于-20 °C保存，可用3個月。（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第二鏈根據(jù)合成cDNA第一鏈時使用的RNA量，下表給出了進(jìn)行LD-PCR時最佳的熱循環(huán)數(shù)。使用的熱循環(huán)數(shù)越少，非特異性PCR產(chǎn)物越少。表2 RNA量與最佳熱循環(huán)數(shù)總RNA/mgPoly A+RNA/mg循環(huán)數(shù)1.0-2.00.5-1.015-200.5-1.00.25-0.520-220.25-0.50.125-0.2522-240.05-0.250.025-0.12524-26LD-PCR反

14、應(yīng)混合物中加入如下物質(zhì)（每個樣品做2個100 ml體系，對照做1個100 ml體系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 mlDeionized H2O 70 ml10×advantage 2 PCR buffer 10 ml50×dNTP mix 2 ml5RACE引物 2 ml3RACE引物 2 mlMelting solution 10 ml50×advantage 2 polymerase mix 2 ml總體積 100 ml按照以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)： 1個循環(huán) 95 °C 30 s X個循環(huán) 95 &#

15、176;C 10 s 68 °C 6 min 1個循環(huán) 68 °C 5 min取7 ml PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測，檢測時使用1 kb DNA ladder。（2） 使用CHROMA SPIN+TE-400柱純化ds cDNA為每一個要純化的cDNA樣品準(zhǔn)備一個CHROMA SPIN+TE-400柱。將純化柱翻轉(zhuǎn)幾次，充分懸浮gel matrix。移去柱的頂蓋和底蓋，將柱放入2 ml收集管中。將柱放入離心機(jī)，700 g離心5 min以消除平衡緩沖液，棄掉收集管中的液體。將柱放入新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使樣品沿柱的內(nèi)壁流下。注：

16、加到邊上易使樣品沿柱內(nèi)壁流下，易混有小片段cDNA。700 g離心5 min，純化的cDNA收集到管中。將兩個純化的cDNA樣品合并到一管，測量體積。加入1/10體積3 mol/L醋酸鈉（pH5.3），混勻。加入2.5倍體積無水乙醇。-20 °C冰凍1 h。室溫，14000 r/min離心20 min。小心棄去上清液，切勿碰到沉淀。14000 r/min瞬時離心，去除殘留上清液。沉淀于空氣中干燥10 min。注：一般干燥至無乙醇味，不可過度干燥，否則很難溶解。用20 ml滅菌去離子水溶解沉淀，此cDNA可用來進(jìn)行同源重組構(gòu)建文庫。純化后的cDNA用1%的瓊脂糖電泳檢測。5 構(gòu)建并篩選

17、酵母單雜交文庫（cDNA融合表達(dá)文庫的構(gòu)建及篩選）（1） 構(gòu)建并在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上檢測Y1HGoldBait/AbAi菌株。注：AbA的濃度根據(jù)構(gòu)建誘餌載體時轉(zhuǎn)入酵母抑制本底表達(dá)時的濃度而定。（2） 按SMART technology步驟合成ds cDNA，其濃度為2-5 mg/20 mL。（3） 用Yeast Transformation System 2的方法轉(zhuǎn)化酵母，在轉(zhuǎn)化體系中加入如下物質(zhì)：cDNA文庫轉(zhuǎn)化Y1HGoldBait/AbAi菌株 20 ml SMART-amplified ds cDNA （2-5 mg） 6 ml pGADT7-Rec，（Sma I-lin

18、earized）（3 mg）Y1HGold 53/AbAi的轉(zhuǎn)化 5 ml p53 fragment （125 mg） 2 ml pGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1 mg）將轉(zhuǎn)化體系分別稀釋至1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 ml涂100 mm平板。文庫轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，對照p53轉(zhuǎn)化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。（4） 將剩余的所有文庫轉(zhuǎn)化混合物（約15 ml）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平板上，每板涂150 ml。（5） 倒置培養(yǎng)3-5 d。（6） 3-5 d后，通過

19、統(tǒng)計(jì)SD/-Leu 100 mm平板上的克隆數(shù)目來計(jì)算篩選的克隆數(shù)。注：所篩選的克隆數(shù)至少應(yīng)該達(dá)到1百萬，否則會降低篩選到目的產(chǎn)物的可能性。篩選的克隆數(shù)=cfu/ml on SD/-Leu×dilution factor×resuspension volume（15ml）例如：resuspension volume=15 mlPlating volume=100 ml250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clones screened=250 cfu/0.1 ml

20、5;100×15 ml=3.75 million（7） 預(yù)期結(jié)果陽性對照試驗(yàn)：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培養(yǎng)基上的克隆數(shù)相近。文庫篩選試驗(yàn)：根據(jù)SD/-Leu平板上的克隆數(shù)計(jì)算所篩選的克隆數(shù)，其結(jié)果應(yīng)大于1百萬且SD/-Leu/AbA平板上的克隆數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于1百萬，陽性克隆數(shù)目取決于誘餌序列。6 陽性克隆的鑒定及cDNA質(zhì)粒的分離（1） 陽性克隆重新劃線培養(yǎng)，進(jìn)行表型確認(rèn)將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重新劃線，產(chǎn)生新的單克隆。2-4 d后，選擇能夠正常生長的克隆進(jìn)行后續(xù)分析。（2） 酵母克隆PCR消除重復(fù)克隆用Matchmaker Insert Check

21、 PCR Mix 2 （Cat.No.630497）進(jìn)行PCR，對插入到pGADT7載體中的cDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR管中加入以下反應(yīng)物： Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 ml H2O/Yeast 25 ml 總體積 50 ml按下述程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 °C 1 min98 °C 10 s68 °C 3 minPCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。產(chǎn)物不是單一的條帶很正常，這表明在同一酵母細(xì)胞不存在一種捕獲載體注：為了確認(rèn)大小相近的條帶是否是同一種插入片段，用Alu I或Hae III或者其它常用的限制性內(nèi)切酶消

22、化PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。如果大量的克隆含有同一插入片段，則另取50個克隆進(jìn)行PCR分析。為了快速驗(yàn)證克隆，PCR產(chǎn)物可經(jīng)過純化后用T7引物測序。（3） 陽性cDNA質(zhì)粒的分離獲取酵母中文庫質(zhì)粒的分開。與轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不同，轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞可以含多種相關(guān)質(zhì)粒，這就意味著陽性克隆里不只含有能激活A(yù)bAr報(bào)告基因的質(zhì)粒，還可能含有一種或多種不表達(dá)相互作用蛋白的cDNA質(zhì)粒。如果不事先將非互作質(zhì)粒分開出去而直接通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲取質(zhì)粒，那么很有可能獲取到非相互作用的質(zhì)粒。為了增加獲取陽性克隆捕獲質(zhì)粒的幾率，可以將陽性克隆在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上重復(fù)涂布2-3次，每次都挑取單一的克隆進(jìn)行下一步涂布。從酵母中獲取陽性cDNA質(zhì)粒 為了鑒定陽性互作相關(guān)的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit （Cat.No.630467）從酵母中獲取陽性質(zhì)