轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用

1、RNA測(cè)序技術(shù)原理測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用及應(yīng)用遺傳的中心法則遺傳的中心法則基因組基因組轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組表觀遺傳組表觀遺傳組蛋白組層蛋白組層次次什么是轉(zhuǎn)錄組？All transcripts All mRNAsRNA是解讀基因組的關(guān)鍵是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinDNA測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)RNA-RNA-SeqSeqSmall RNA測(cè)序測(cè)序降解組測(cè)序降解組測(cè)序Non-coding RNA測(cè)序測(cè)序研究對(duì)象研究對(duì)象mRNASmall RNAmRNANon-coding RNA鑒定新分子鑒定新分子OOOO表達(dá)譜研究表達(dá)譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST 測(cè)序測(cè)序O/XXXX 篩選分子

2、標(biāo)記篩選分子標(biāo)記 OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因轉(zhuǎn)錄融合基因表達(dá)表達(dá)O/XXXXRNA 測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)樣品檢測(cè)文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析Total RNA樣品檢測(cè)樣品檢測(cè) Agilent 2200 檢測(cè)檢測(cè)OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7 新型安捷倫2200 TapeStation 系統(tǒng)是新一代測(cè)序（新一代測(cè)序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（質(zhì)量控制（QC）的理想

3、解決方案。 可擴(kuò)展的通量16聯(lián)或96孔微量滴定板 快速得到結(jié)果平均每個(gè)樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果 使用簡(jiǎn)單可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡(jiǎn)化了工作流程 樣品用量少每次運(yùn)行僅需要不到2ul樣品檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告- -合格樣品合格樣品棉鈴蟲/果蠅檢測(cè)報(bào)告檢測(cè)報(bào)告- -不合格樣品不合格樣品Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)樣品檢測(cè)文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析真核真核mRNA的純化的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3的poly

4、 A與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）原核原核mRNA的純化的純化Ambion MICROExpress KitLNA扣鎖型探針扣鎖型探針mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄-fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc 糖原 無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTds cD

5、NA末端修復(fù)(防止自連）cDNA 3末端加AAdapter連接第一天第一天消化消化DNAmRNA的分離的分離mRNA的打斷的打斷cDNA的合成的合成第二天第二天末端修復(fù)末端修復(fù) 加接頭加接頭膠回收膠回收3端加端加A第三天第三天PCRPCR膠回收膠回收 文庫制備文庫制備 文庫質(zhì)量檢測(cè)：文庫質(zhì)量檢測(cè)：Aligent 2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測(cè)：跑膠驗(yàn)證。Workflow of RNA-Seq樣品檢測(cè)樣品檢測(cè)文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析ApplicationRNA-Seq (單端測(cè)序單

6、端測(cè)序-Quantification)RNA-Seq (雙端測(cè)序雙端測(cè)序-Transcriptome)Expression-profilingAlternative SplicingFusion GeneSNP detectionHiSeq 2500Applications of RNA-Seq17RNA-Seq (Transcriptome)Workflow of RNA-Seq(Transcriptome)生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析RNA-Seq (Transcriptome)Characterize the transcriptome in unparalleled detailTec

7、hnique 220RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)RNA-Seq (Transcriptome resequencing)RNA-Seq (De novo transcriptome assembly)文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建測(cè)序測(cè)序組裝組裝De novo assemble a transcriptome組裝流程組裝流程 數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估 組裝結(jié)果分析（Contig 長(zhǎng)度分布、Scaffold 長(zhǎng)度分布、Unigene 長(zhǎng)度分布） Unigene （transcript）功能注釋 Unigene 的GO 分類 Unigene 代謝

8、通路分析 預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS） Unigene 表達(dá)差異分析（兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品） Unigene 在樣品間的差異GO 分類（需兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）和Pathway 富集性分析De novo assembly transcriptome 信息分析主要信息分析主要內(nèi)容內(nèi)容：De novo assembly transcriptome信息分析流程信息分析流程Unigenes的的GO 注釋注釋Pathway 分析分析RNA-Seq (Transcriptome resequencing)cDNA文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建測(cè)序測(cè)序比對(duì)到參考序列比對(duì)到參考序列Transcriptome resequencin

9、g比對(duì)流程比對(duì)流程 比對(duì)統(tǒng)計(jì) 基因表達(dá)注釋 基因差異表達(dá)分析 基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化 可變剪接分析 預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本 cSNP分析Transcriptome resequencing信息分析主要內(nèi)容信息分析主要內(nèi)容Transcriptome resequencing信息分析流程信息分析流程應(yīng)用應(yīng)用-優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息l基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化l可變剪接鑒定可變剪接鑒定l基因融合鑒定基因融合鑒定lRNA水平水平SNP分析分析Genomic intergenic regionReadsclusterPaired Readsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)鑒定新的轉(zhuǎn)錄本鑒定新的轉(zhuǎn)

10、錄本Paired-End (PE) ReadsReads 比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域鑒定可變剪接（鑒定可變剪接（ Alternative Splicing ）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA鑒定基因融合鑒定基因融合Paired ReadsSingle ReadsGene AGene B分析分析RNA水平水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：SOAPDe novo 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序: 組裝軟件：組裝軟件：SoapDenovo比對(duì)軟件：比對(duì)軟件： S

11、oapSNP36轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTiling ArraycDNA or EST sequesing Transcriptome SequencingPrincipleHybridizationSanger sequencingNext-GensequencingResolutionFrom several to 100Single baseSingle baseThroughputHighLowHighReliance on genomic sequenceYesNoIn some casesBackground noiseHighLowLowA

12、pplicationSimutaneously map transcribed regions and gene expressionYesLimited for expressionYesDynamic range to quantify gene expression levelUp to a few-hundred foldNot practical 8,000-foldAbility to distinguish different isoforms and allelic expressionLimitedYesYes轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)序與芯片檢測(cè)基

13、因數(shù)比較測(cè)基因數(shù)比較 RNA測(cè)序與芯片測(cè)序與芯片檢測(cè)基因的表達(dá)量分布檢測(cè)基因的表達(dá)量分布Technique 1Genome Res 2010CaseCase 實(shí)驗(yàn)材料收集：實(shí)驗(yàn)材料收集： 葉片，花序, 果實(shí), 根 時(shí)間點(diǎn)：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品均勻混合 測(cè)序策略：測(cè)序策略： Illumina 測(cè)序，1G data1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接抗逆相關(guān)可變剪接外包膜蛋白外包膜蛋白16 (AT2G28900)Intron-retentionControlLow Tem

14、perature Resistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個(gè)內(nèi)含子和對(duì)照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能。AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)等RNA-RNA-SeqSeq單端測(cè)序單端測(cè)序（QuantificationQuantification）等同于等同于數(shù)字表達(dá)譜數(shù)字表達(dá)譜(DGE)(DGE)Workflow of RNA-Seq單端測(cè)序單端測(cè)序（Quantification）生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析RNA-Seq單端測(cè)序（單端測(cè)序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容生物信息分析內(nèi)容v測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估v篩選差異表達(dá)基因篩選差異

15、表達(dá)基因v表達(dá)模式聚類分析表達(dá)模式聚類分析vGO 功能富集分析功能富集分析vPathway 富集分析富集分析v蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析RNA-Seq單端測(cè)序（單端測(cè)序（Quantification）信息分析流程）信息分析流程RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-seq1）檢測(cè)基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)0.99）3）數(shù)字化信號(hào)，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因高、低豐度基因均均可檢測(cè)可檢測(cè)5）不受研究物種限制，不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測(cè)6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有

16、較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺(tái)應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺(tái)要求樣品量少1）檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測(cè)閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率1%3）受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測(cè)出低豐度基因無法檢測(cè)出低豐度基因5）只能檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本，無法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋注釋不準(zhǔn)確不準(zhǔn)確的情況casecase取樣：取樣： 選取在成熟季節(jié)開花后 5, 10, 和15個(gè)星期葡萄分別代表葡萄果實(shí)成熟中的三個(gè)時(shí)期（post setting, veraison和ripening）數(shù)據(jù)量：數(shù)據(jù)量： 超過59M reads數(shù)據(jù)， 長(zhǎng)度在36-44bp之間運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育過程中復(fù)雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。表二表二 reads在基因組上的分布情況在基因組上的分布情況表一表一 測(cè)序數(shù)據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)葡萄葡萄RNA-Seq單端單端測(cè)序測(cè)序漿果發(fā)育三個(gè)階段漿果發(fā)育三個(gè)階段共有、特有共有、特有基因基因表達(dá)分布圖表達(dá)分布