影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子

1、影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子黃世文1, 余柳青1, A lan K 1W atson 2(11中國水稻研究所, 杭州310006; 21Internati onal R ice Research Institute , P 1O 1Box 933, M anila 1099, Phili pp ines 摘要:在實驗室研究了影響稗草病原真菌鏈格孢生長及產(chǎn)孢的因子。鏈格孢菌可在較寬的溫度范圍內(nèi)生長、繁殖; 連續(xù)黑暗、空氣充足條件下有利于產(chǎn)孢; 該菌在4種不同的植物產(chǎn)品上培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的孢子, 最多的無芒稗籽上每克干物質(zhì)產(chǎn)孢量達3159×108個, 這些培養(yǎng)物在首次產(chǎn)孢收獲后均可直接培養(yǎng)

2、作二次產(chǎn)孢利用。固體(菌塊 和液體(菌懸液 接種培養(yǎng)物均能成功產(chǎn)孢。但培養(yǎng)量大時液體接種優(yōu)于固體接種, 產(chǎn)孢量與接種菌懸液濃度呈正相關(guān)。關(guān)鍵詞:鏈格孢菌; 生長; 產(chǎn)孢; 生物防治分類號:S 45; Q 949. 331+. 3文獻標(biāo)識碼:A : 0120016204目前, 3選、4s pp . 是一類寄主范圍很廣的病原真菌, , 如決明鏈格孢(A . 、望江南、美麗豬屎豆; 百日草鏈格孢(A . z inniae 防治蒼耳; 粗鏈格孢(A . crassa 防治曼陀羅等79。一般認為, 真菌微生物制劑多是利用其孢子, 這是因為孢子不論是穩(wěn)定性、活力、侵染力還是壽命等方面均比真菌其它階段更具優(yōu)

3、勢10。因此, 開發(fā)廉價、高效、可大量生產(chǎn)菌孢子的培養(yǎng)基及其技術(shù)是真菌微生物制劑成功的關(guān)鍵。稗草鏈格孢菌A lternaria alternata (F r . Keissler 是從田間自然罹病的稗草標(biāo)樣上分離獲得, 經(jīng)生測, 該菌對稗草致病力強, 鮮重防效在60%左右, 對水稻小苗有輕度影響, 但隨后可恢復(fù)正常。在從稗草病標(biāo)樣中分離到的近百個病原菌中, 該菌占41. 3%, 是感染稗草造成葉片和葉鞘病斑的主要病原真菌之一, 本文研究了影響該菌生長及產(chǎn)孢的多種因子。1材料與方法1. 1菌種的分離、培養(yǎng)和保存鏈格孢菌是作者從田間自然感病稗草標(biāo)樣中分離獲得, 經(jīng)單孢純化后在半強度PDA 斜面培養(yǎng)

4、基上于4保存?zhèn)溆?。接種時移入PDA 培養(yǎng)基平板中央, 于28±0. 5恒溫培養(yǎng)7天, 取邊緣、生長旺盛的菌絲塊作為接種體。1. 2溫度對菌生長及產(chǎn)孢的影響直徑9c m (下同 消毒培養(yǎng)皿中倒入20m l PDA 培養(yǎng)基, 接入7mm 直徑菌塊, 處理溫度:收稿日期:2000204218基金項目:農(nóng)業(yè)部“九五”高新技術(shù)重點項目(02-03-03 ; 國際合作項目作者簡介:黃世文(19622 , 男, 學(xué)士, 副研究員。6117(1 1619中國生物防治Ch inese Journal of B i ol ogical Control 2001年2月(1 28±0. 5恒溫;

5、(2 9月份室溫, 晝 夜溫度28 20左右; (3 12月份室溫, 晝 夜溫度20 8左右; (4 溫室:溫度13±133±1(室溫、溫室溫度用最高最低寒暑表每天記錄, 下同 ,處理后2天以十字交叉法測量菌落直徑, 每隔1天測量1次, 直到生長最快的處理長滿培養(yǎng)皿, 同時觀察菌落顏色、形狀。最后一次測量后, 用含0. 05%吐溫220的無菌水20m l 刮下菌落及孢子, 裝廣口瓶中充分搖勻, 用2層紗布過濾得菌懸液, 用血球計數(shù)器在顯微鏡下測量孢子含量, 并最終計算出每皿產(chǎn)孢數(shù)。各處理重復(fù)3次, 以下均相同。1. 3光照、通氣對產(chǎn)孢的影響培養(yǎng)皿中倒入20m l PDA 培

6、養(yǎng)基, 接種菌塊后, A 組培養(yǎng)皿用parafil m 膠帶封口, B 組不封口。處理(1 置恒溫28±0. 5連續(xù)黑暗培養(yǎng); (2 用3層黑布包裹(模擬連續(xù)黑暗 置9月份室溫; (3 不用布包裹置室溫(自然光 培養(yǎng)7、14天。按1. 2法收集、計算每皿產(chǎn)孢數(shù)。1. 4不同培養(yǎng)基質(zhì)對產(chǎn)孢的影響稱取大麥、小麥、無芒稗籽粒、米糠及曬干后的稗稈、稗葉(0. 5c m 長 各10g 置250m l 三角瓶中, 除米糠加5m l 溫開水(拌勻達飽和不滴水 外, 其他均加水10m l 預(yù)浸24小時, 121高溫高壓處理30分鐘, 取出冷卻后接菌種2塊, 充分搖勻。置28±0. 5天,

7、用100m l 0105%吐溫220無菌水洗下孢子, 2層紗布過濾, 1. , 計算每克干物質(zhì)產(chǎn)孢量。, 作二次產(chǎn)孢試驗。71. 5。(1 菌塊(固體 接種; (2 菌懸液(液體 接種:2m l 濃度為3. 5×106個孢子 m l 菌懸液, 接于10g 稗籽上, 充分搖勻, 作如下處理:置恒溫28±0. 5黑暗培養(yǎng); 置12月室溫培養(yǎng); 置溫室13±133±1培養(yǎng); (3 不同濃度菌懸液接種:50g 干稗籽裝入500m l 三角瓶中, 加50m l 溫開水預(yù)浸24小時消毒后分別用5塊1c m 直徑菌塊和10m l 菌懸液接種, 菌懸液濃度分別為3. 5

8、×107、3. 5×108、3. 5×109個 m l , 置恒溫、溫室和12月室溫條件下培養(yǎng), 分別在7、14、21天按1. 4法收獲孢子, 計算產(chǎn)孢量, 進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2. 1溫度對菌生長及產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌菌落在28±0. 5恒溫下開始生長速度較快, 前2天生長速度為7. 5mm d , 后為11mm d ; 在9月室溫較高、晝夜溫差不大的情況下, 菌落生長較好, 室溫較低的12月和晝夜溫差較大的溫室, 菌落生長較慢(表1 。生長較快的處理, 菌絲豐富, 孢子相對較少; 相反, 生長較慢的處理菌絲較少, 相對地孢子產(chǎn)量較高。菌絲(孢子

9、初為淡黃至黃褐色, 隨著培養(yǎng)時間延長, 逐漸轉(zhuǎn)為黑色。2. 2光照、通氣對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌在PDA 培養(yǎng)基上, 不同處理條件下產(chǎn)孢水平差異顯著。連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng), 不論是恒溫還是室溫自然條件, 培養(yǎng)皿不用parafil m 封口時產(chǎn)孢能力強, 封口條件下菌株產(chǎn)孢能力明顯降低; 室溫不封口連續(xù)黑暗培養(yǎng)產(chǎn)孢能力要強于室溫不封口自然光照(表2 。說明連續(xù)黑暗, 空氣充足條件下有利于該菌產(chǎn)孢。71第1期黃世文等:影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子表1溫度對鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的影響處理菌落直徑(mm 2d4d 6d 8d 8d 產(chǎn)孢量(107個 皿恒溫15. 0a 45. 5a 64. 0a 86. 5a

10、4. 6c 溫室11. 5c 36. 5b 56. 5b 75. 5ab 8. 3a 室溫12月13. 0b 41. 0ab 59. 5b82. 0a 3. 9d 室溫9月8. 8d12. 0c39. 5c68. 0b7. 2b注:同列數(shù)據(jù)后不同字母表示5%水平下差異顯著, 下同。表2光照和通氣對產(chǎn)孢的影響條件處理方法7d 14d恒溫黑暗封口0. 86d 3. 37c黑暗不封口3. 16b 16. 04a 室溫9月黑暗封口0. 58e 3. 04c 黑暗不封口6. 64a 15. 96a 自然光封口0. 37f 2. 78c 自然光不封口1. 57c14. 56b注:封口指用parafli m

11、 膠帶密封培養(yǎng)皿。2. 3不同培養(yǎng)基質(zhì)對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌在無芒稗籽、稗莖、稗葉、大麥粒、小麥粒、米糠4種不同植物產(chǎn)品上都能大量產(chǎn)生孢子(表3 , 菌株在這些物質(zhì)中培養(yǎng)7或14天收獲孢子后, 培養(yǎng)基質(zhì)還可繼續(xù)培養(yǎng)作二次產(chǎn)孢利用, 其中在無芒稗籽上產(chǎn)孢量最多。培養(yǎng)7和14天每克干稗籽兩次產(chǎn)孢之和分別可達3. 59×108和3. 16×108個孢子。產(chǎn)孢量較少的米糠每克干物質(zhì)的兩次產(chǎn)孢量之和也分別達到1. 09×108和7. 56×107個孢子, 其產(chǎn)孢量與在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的每皿產(chǎn)孢量相當(dāng)。鏈格孢菌在稗稈和稗葉上均能大量產(chǎn)生孢子, 兩者產(chǎn)量相差不大

12、, 。表3不同培養(yǎng)基質(zhì)對產(chǎn)孢的影響(107 培養(yǎng)物7d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢14d二次產(chǎn)孢14d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢米糠0. 50f356. 無芒稗籽13. 20a 22. 72a 16. 30a15. 30a 麥粒. 939. 6. c 8. 40b 稗稈6. 52b 4. 36e 8. 61b 3. 14e 大麥粒3. e 8. 80d8. 95b 4. 13d 稗葉5. 86c4. 02e6. 29c2. 78ePDA10. 57-33. 50-2. 4接種方法和接種濃度對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌不論是采用固體還是液體接種, 不論恒溫、室溫和溫室條件下均可在無芒稗籽上大量產(chǎn)生孢子。在培養(yǎng)物較少(10g

13、稗籽 的情況下, 固體接種產(chǎn)孢量多于液體接種。但隨著培養(yǎng)量的增加(50g 稗籽 、接種菌懸液濃度的提高, 液體接種法每克無芒稗籽產(chǎn)孢量明顯多于固體接種的產(chǎn)孢量(圖 。A :菌塊接種; B :菌懸液接種(3. 5×107 m l ; C :菌懸液接種(3. 5×108 m l ; D :菌懸液接種(3. 5×109 m l 圖不同接種方法、濃度鏈格孢菌在無芒稗籽上的產(chǎn)孢比較3討論鏈格孢菌適應(yīng)性強, 相對較低或較高的溫度只能減緩而不會抑制其生長繁殖, 晝夜變溫更81中國生物防治第17卷有利于孢子形成。鏈格孢菌生長繁殖快, 對營養(yǎng)要求低, 產(chǎn)孢能力強, 在一些廉價農(nóng)產(chǎn)品

14、上均可大量產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)基質(zhì)在第一次收獲孢子后還可作二次產(chǎn)孢利用。其生長及產(chǎn)孢特性正是病原菌成為微生物制劑所必須的。連續(xù)黑暗、空氣充足條件下有利于鏈格孢菌產(chǎn)孢。鏈格孢菌對稗草及其它雜草的致病性, 寄主范圍特別是對水稻及相近的禾本科作物的毒性還需作進一步的研究, 該菌與其它雜草病原菌、化學(xué)除草劑混用對雜草的防效也值得探討。參考文獻1Tebeest O D , Yang X B, et al . The status of bi ol ogical control of w eeds w ith fungal pathogens J . A nn . Rev .Phytopathol. , 199

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