呼吸道聯(lián)檢操作規(guī)程SOP資料

1、_室（SOP）文件撰 寫 人： 審 核 人： 批 準 人： 批準日期： 2007年 7月31日啟用日期： 2007年 8月 1 日二零零七年七月一日制批準頁根據(jù)臨床檢驗操作規(guī)程(2006年,第三版)，化學放光儀 （Anthos lucy）, 洗板機（Anthos fluido）使用說明書；免疫檢驗有關試劑盒、質控品的使用操作說明書；消毒技術規(guī)范以及醫(yī)院內部有關管理制度、生物安全制度的規(guī)定和要求，臨床免疫檢驗操作規(guī)程文件NO.2版經實際運行，現(xiàn)予以批準通過，于 2007年 8月 1日起生效并開始實施。免疫室和檢驗科有關工作人員必須認真學習，嚴格遵照執(zhí)行。（NO.2版依據(jù)檢驗技術和我科工作發(fā)展及管

2、理工作的需求進行的補充完善和改進另行通知）。任何個人不得更改，實際工作中如發(fā)現(xiàn)不妥之處，請按程序以文字形式向審核人匯報；在未經批準人同意/批準新文件之前，仍執(zhí)行此文。_醫(yī)院檢驗科2007年7月31日呼吸道九聯(lián)檢操作規(guī)程1. 項目中文名稱：九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測（間接免疫熒光法）項目英文名稱：PNEUMOSLIDE IgM2.實驗原理與方法：2.1 原理：間接免疫熒光法（IFA）是基于待測樣本中的抗體與吸附在載玻片上的抗原發(fā)生的反應。樣本中存在的特異性抗體和抗原反應，未與抗原結合的免疫球蛋白在洗滌步驟中除去。在下一步驟中，抗原-抗體復合物與熒光素標記的抗人球蛋白反應。用免疫熒光顯微鏡

3、觀察結果。2.2 方法：間接免疫熒光法3.設備性能參數(shù)：4.標本的要求：需由專業(yè)人員無菌靜脈穿刺采集血液。使用消毒或無菌技術能保持樣本的完整性。血清樣本采集后如不在8小時內檢測應28 ºC冷藏，如7天內不檢測，則應冷凍（-20ºC）保存。不要反復凍融以防止免疫球蛋白滴度降低，特別是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若樣本中含有微粒要離心使之澄清。4.儀器：熒光顯微鏡5.試劑廠家及名稱：西班牙VIRCELL公司6.操作步驟：1. 使用前，將所有試劑平衡至室溫。載玻片平衡至室溫后再打開。2. 樣本的稀釋：按1:1比例稀釋血清樣本，即25µL血清加入25µL

4、 PBS2中。陰陽性對照34不需要稀釋。3. 用抗人IgG吸附劑7 處理稀釋后的血清：將30µL稀釋后的血清加入150µL吸附劑中，徹底混勻。陰陽性對照3 和4 不需吸附劑處理。處理后的血清要離心10-15分鐘除去沉淀，以防干擾檢測。4. 在載玻片1 的每孔中加15µL吸附劑處理過的血清（一份樣本對應一個載玻片）。在一個載玻片的每孔中加入15µL不稀釋的陽性對照3，在另一個載玻片的每孔中加入15µL不稀釋的陰性對照4。5. 將載玻片放入濕盒中，37溫育90分鐘。6. 用PBS 2 的緩慢水流沖洗載玻片1（避免直接沖入孔內）后，浸泡在PBS中并放

5、置在水平搖床上輕輕搖動10分鐘。再用蒸餾水緩慢水流沖洗（避免直接沖入孔內）。7. 載玻片1 自然晾干。8. 每孔加入15µL抗人IgM FITC結合物溶液5M（不需稀釋）。9. 將載玻片放入濕盒，37溫育30分鐘。10. 重復6和7的洗滌步驟。11. 加幾小滴封閉介質6，小心蓋上蓋玻片。12. 盡快用熒光顯微鏡在400倍放大率下觀察結果。如果不能立即觀察，可將其避光放置于2-8ºC不超過24小時。* 簡明操作程序（將風干改成晾干）7. 有效性判斷每一次試驗都應設立陽性和陰性對照，以確認試驗和試劑盒的有效性。觀察到的熒光模式應為：陽性對照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副

6、流感病毒對陽性質控的1-15%細胞出現(xiàn)蘋果綠細胞核、胞漿或胞膜熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞）；軍團菌、衣原體或立克次體中所有的細菌呈現(xiàn)出蘋果綠熒光；支原體對陽性質控在細胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光。陰性對照：軍團菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細胞呈現(xiàn)紅色。判斷陽性結果：可以觀察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒對陽性血清的1-15%細胞的細胞核、胞漿或胞膜出現(xiàn)蘋果綠色熒光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同時觀察到著色的合胞）；軍團菌、衣原體或立克次體中所有的細菌呈現(xiàn)出蘋果綠色熒光；支原體對陽

7、性血清在細胞外圍呈現(xiàn)蘋果綠色熒光。陰性結果：可觀察到軍團菌、肺炎衣原體和立克次體無熒光，支原體、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的細胞呈現(xiàn)紅色。9.檢驗結果的解釋1. 每一批產品在放行前都要經過更加嚴格的內部質量控制（Q.C.）的檢驗。質控品可溯源到經過內部確認的參考血清盤。2. 如果所有細胞或第10孔出現(xiàn)熒光表明存在抗核或抗細胞抗體，不能判為陽性，應用其他方法進行檢測。當質控孔中無熒光時一定要查明病因。3. 由于非軍團菌感染的病人中經常出現(xiàn)交叉抗體，軍團菌陽性結果需結合臨床癥狀綜合評價。建議做較高稀釋度的檢測來提高陽性預測值。4. 與說明書中所列結果不同不能判為陽性。5

8、. 在初次感染和再次感染的過程中，IgG和IgM抗體有不同的表現(xiàn)方式：初次感染時，幾乎在所有的情況下IgM和IgG均出現(xiàn)（IgM早于IgG出現(xiàn)）；而再次感染時可能不出現(xiàn)IgM，因此IgG的檢測是唯一有用的診斷方法。在許多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM一般情況下僅在感染后23個月存在于血清中，因此是近期感染的一個有效標志物。6. 九種病原體IgM抗體陰性及陽性結果的熒光染色圖譜： 陽性結果圖譜：陰性結果圖譜：10.檢驗方法的局限性1. 本試劑盒用于檢測人血清。2.建議用戶仔細閱讀和理解說明書，嚴格按照程序進行操作才能獲得可靠的檢測結果。特別是樣本和試劑的正確吸取以及仔細的洗板

9、、溫育的時間控制對獲得準確結果都很重要。3. 樣本的檢測結果應與臨床評價以及其他診斷方法結合使用。4. 本檢測不能指出感染部位，不能單獨使用。5. 抗體水平無顯著上升時不能排除感染的可能性。6. 在感染早期采集的樣本可能檢測不到IgG，在這種情況下建議采用IgM檢測，或者在14-21天后采集第二個血清樣本，并與原標本同時檢測來確定是否發(fā)生血清轉換。7. 嬰兒的IgG檢測結果要作謹慎解釋，因為出生前母體的IgG被動的傳遞給了胎兒。對6個月以下的嬰兒IgM檢測是更為有用感染標志物。8. 單一樣本抗體檢測結果不能幫助作出近期感染的診斷。應采集雙份樣本（急性期和康復期）同時檢測來觀察血清轉化或抗體水平

10、的明顯升高。9. 對患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA檢測時，支原體、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，會在細胞上發(fā)生非特異性反應，這些血清不能用本方法評價。質控孔用于檢測這種現(xiàn)象。在嗜肺軍團菌和Q熱立克次體中，有時血清會含有與卵抗原反應的抗體，所以使用卵黃囊固定抗原會出現(xiàn)非特異性熒光。當出現(xiàn)這種情況時，該血清就不能用IFA進行分析了。10. 未對本檢測在療效隨訪方面的性能做過評估。11. 除了肺炎外，未對本技術在肺炎衣原體引起的其他疾病方面的性能作過評估。性能指標1. 靈敏度和特異性嗜肺軍團菌血清1型：與另一個商品化的IFA試劑盒對照檢測82份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度

11、特異性IgM 8294.4%98.4%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。肺炎支原體：與一種ELISA試劑盒對照檢測62份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 6296.8%100.0%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。Q熱立克次體：與另一個商品化的IFA試劑盒對照檢測74份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 74100.0%97.6%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。肺炎衣原體：與另一個商品化的IFA試劑盒對照檢測61份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 61100.0%980%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。腺病毒：與一種ELISA試劑盒

12、對照檢測74份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 7485.7%97.0%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。呼吸道合胞病毒：與一種ELISA試劑盒對照檢測97份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 9793.8%100.0%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。甲型流感病毒：與一種ELISA試劑盒對照檢測46份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 4694.1%96.4%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。乙型流感病毒：與一種ELISA試劑盒對照檢測40份血清樣本，結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 40100.0%96.4%有非特異性反應的的血清從最終計

13、算中刪除。副流感病毒1、2和3型：與一種ELISA試劑盒對照檢測36份血清樣本。結果如下：樣本數(shù)靈敏度特異性IgM 36100.0%96.3%有非特異性反應的的血清從最終計算中刪除。2. 精密度分析內精密度：在相同實驗條件下由同一個操作人員在同一次試驗中對3份血清（2份陽性和1份陰性）分別進行5組加樣檢測。結果：滴度變化不超過一個稀釋度。分析間精密度：在5種不同條件下（不同操作人員或不同試驗日期）對3份血清（2份陽性和1份陰性）進行檢測。結果：滴度變化不超過一個稀釋度。3. 交叉反應和干擾嗜肺軍團菌血清1型：檢測20份細菌綜合病癥組（肺炎支原體、肺炎衣原體和Q熱立克次體）、革蘭氏陰性細菌（布魯

14、氏菌，沙門氏菌）和抗核抗體陽性血清樣本。肺炎支原體：檢測12份細菌綜合病癥組（嗜肺軍團菌、肺炎衣原體和Q熱立克次體）陽性血清樣本。Q熱立克次體：檢測20份細菌綜合病癥組（肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌）、同種屬的細菌（發(fā)疹傷寒等的病原體）和抗核抗體陽性血清樣本。肺炎衣原體：檢測20份細菌綜合病癥組（嗜肺軍團菌、Q熱立克次體和肺炎支原體），同種屬的細菌（發(fā)疹傷寒等的病原體）和抗核抗體陽性血清樣本。腺病毒：檢測8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）陽性血清樣本。呼吸道合胞病毒：檢測10份病毒綜合病癥組（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根據(jù)病毒分類（麻疹）陽性血清

15、樣本。甲型流感病毒：檢測8份病毒綜合病癥組（RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）陽性的血清樣本。乙型流感病毒：檢測8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）陽性血清樣本。副流感病毒血清1、2和3型：檢測8份病毒綜合病癥組（RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒）陽性血清樣本。結論：檢測結果表明本試劑盒與上述參考品無交叉反應或干擾，從而證實了該試劑盒的特異性反應。其它干擾研究對25份類風濕因子陽性血清進行了2種病毒和2種細菌抗原IgG和 IgM 抗體的檢測。對另外兩份血清進行了每種抗原IgG 和IgM抗體的檢測。在IgM檢測中，用抗IgG抗體對血清進行了吸附處理。結果顯示，

16、吸附劑可以有效避免類風濕因子的干擾。經驗證，吸附劑也可以有效地避免IgG抗體過量造成的假陰性。17.注意事項和安全防護措施1. 本產品用于體外診斷，僅限專業(yè)人員使用。2. 僅使用試劑盒內的組分，不要混用不同試劑盒或不同廠家的試劑組分。3. 每步操作必須使用干凈吸頭，僅使用干凈的耗材，最好是一次性使用的耗材。4. 包裝如有損壞請勿使用。5. 切勿用嘴吸移液管加樣。6. 本試劑盒中的吸附劑、結合物和質控血清含有動物源性物質，質控血清還含有人源性物質。盡管本試劑盒中的人血清質控品已經測試為HBsAg、HCV抗體和HIV抗體陰性，質控血清和病人樣本仍應作為潛在感染性物質進行處理?？變劝坏慕洔缁畹氖确?/p>

17、軍團菌血清1型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型，也仍應視為具有潛在感染性并小心處置。目前沒有方法可以確保這些或其他感染性物質不存在，因此所有的材料應視為具有潛在感染性進行處置，應遵守當?shù)仃P于臨床廢棄物處理的法規(guī)。7. 結合物、吸附劑、封閉介質和質控品含有疊氮鈉（濃度0.1%），避免接觸酸和重金屬。8. 封閉介質含有甘油，請勿接觸酸和暴露在高溫下。9. 伊文斯藍（濃度0.1%）是一種致癌物。請勿接觸皮膚和眼睛。萬一接觸到該溶液，用水徹底沖洗并到醫(yī)院檢查。10. 僅按本說明書進行操作，不遵守規(guī)定的溫育時間和溫度會導致

18、錯誤的結果。11. 載玻片上病人樣本交叉污染會導致錯誤結果，要小心操作防止發(fā)生。12. 顯微鏡光學系統(tǒng)、光源條件和類型會影響熒光質量。13. 不要將試劑不必要地放置在室溫下過長的時間。14. 每個載玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用沒有用過的孔。15. 試劑盒里的玻璃組分破碎時可能傷及身體，小心處理。16. 吸附劑加入樣本后要注意觀察是否有明顯的沉淀出現(xiàn)。18. 標簽符號：體外診斷用醫(yī)療器械使用有效期 8ºC2ºC 儲存條件 2-8ºCå xx可用于檢測的次數(shù)（規(guī)格）批號目錄號使用說明書每個載玻片上反應孔的數(shù)量19.參考文獻1. Berdal, B

19、. P.; Fields, P. I., and Melbye, H. Chlamydia pneumoniae respiratory tract infection: the interpretation of high titres in the complement fixation test. Scand J Infect Dis. 1991; 23(3):305-7.2. Buchner, Y. I.; Heath, R. B.; Collins, J. V., and Pattison, J. R. Serum IgM antibody and influenza A infec

20、tion. J Clin Pathol. 1977 Aug; 30(8):723-7.3. Champsaur, H.; Fattal-German, M., and Arranhado, R. Sensitivity and specificity of viral immunoglobulin M determination by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol. 1988 Feb; 26(2):328-32.4. De Ory, F.; Echevarria, J. M.; Pelaz, C.; T

21、ellez, A.; Mateo, M. A., and Lopez, J. Detection of specific IgM antibody in the investigation of an outbreak of pneumonia due to Legionella pneumophila serogroup 1. Clin Microbiol Infect. 2000 Feb; 6(2):64-9.5. Dupuis, G.; Peter, O.; Peacock, M.; Burgdorfer, W., and Haller, E. Immunoglobulin respon

22、ses in acute Q fever. J Clin Microbiol. 1985 Oct; 22(4):484-7.6. Echevarria, J. M.; Leon, P.; Balfagon, P.; Lopez, J. A., and Fernandez, M. V. Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by microparticle agglutination and antibody-capture enzyme-immunoassay. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1990 Ma

23、r; 9(3):217-20.7. Edelstein. Detection of antibodies to Legionella. En Rose, N.R., Conway de Macario, E., Fahey, J.L., Friedman, H., Penn, G.M. (eds). Manual of Clinical Laboratory Immunology (4ª Ed) American Society for Microbiology. Washington. 1992. pp:459-466.8. Field, P. R.; Hunt, J. G., a

24、nd Murphy, A. M. Detection and persistence of specific IgM antibody to Coxiella burnetii by enzyme-linked immunosorbent assay: a comparison with immunofluorescence and complement fixation tests. J Infect Dis. 1983 Sep; 148(3):477-87.9. Grdanoska T; Petrovska M; Cvetkovic D; Kotevska V; Dokic-Trajkov

25、ska E; Kondova I, and Panovski N. Pneumo-slide: serologicalinvestigation of human respiratory infections. 2nd Balkan Conference of Microbiology. Thessaloniki. 2001. 10. Hunt, J. G.; Field, P. R., and Murphy, A. M. Immunoglobulin responses to Coxiella burnetii (Q fever): single-serum diagnosis of acu

26、te infection, using an immunofluorescence technique. Infect Immun. 1983 Feb; 39(2):977-81.11. Julkunen, I.; Lehtomaki, K., and Hovi, T. Immunoglobulin class-specific serological responses to adenovirus in respiratory infections of young adult men. J Clin Microbiol. 1986 Jul; 24(1):112-5.12. Korppi,

27、M.; Halonen, P.; Kleemola, M., and Launiala, K. The role of parainfluenza viruses in inspiratory difficulties in children. Acta Paediatr Scand. 1988 Jan; 77(1):105-11.13. Lee, S. H.; Charoenying, S.; Brennan, T.; Markowski, M., and Mayo, D. R. Comparative studies of three serologic methods for the m

28、easurement of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Am J Clin Pathol. 1989 Sep; 92(3):342-7.14. Peter, O.; Dupuis, G.; Peacock, M. G., and Burgdorfer, W. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and complement fixation and indirect fluorescent-antibody tests for detection of Coxiella burnetii ant

29、ibody. J Clin Microbiol. 1987 Jun; 25(6):1063-7.15. Toms, G. L.; Webb, M. S.; Milner, P. D.; Milner, A. D.; Routledge, E. G.; Scott, R.; Stokes, G. M.; Swarbrick, A., and Taylor, C. E. IgG and IgM antibodies to viral glycoproteins in respiratory syncytial virus infections of graded severity. Arch Dis Child. 1989 Dec; 64(12):1661-5.16. Urquhart, G. E. Serum IgM and IgA responses in influenza A infections. J Clin Pathol. 1974 Mar; 2