不同啤酒酵母在不同發(fā)酵條件下發(fā)酵性能的比較

1、啤酒是世界上產(chǎn)量最大的酒種，是世界性飲料酒。啤酒起源于大約在九千年前的中東古巴比倫與古埃及地區(qū)。中國在四五千年前就有古代啤酒，據(jù)尚書記載，中國周朝時期就有了啤酒。啤酒是以大麥麥芽、大米、啤酒花等為主要原料，經(jīng)啤酒酵母和釀造水釀制而成的一種含CO2的低濃度酒精飲料，是酒類中酒精含量最低的飲料酒。啤酒性平和、味甘，具有清爽的苦味，有幫助消化、促進(jìn)循環(huán)，滋補(bǔ)身體的功效。啤酒中不含防腐劑，且是在嚴(yán)格的衛(wèi)生監(jiān)控下，生產(chǎn)設(shè)備全部采用不銹鋼材料，經(jīng)過數(shù)周精心釀造而成。啤酒產(chǎn)品富含營養(yǎng)，是上等的液體食品，適量飲用有益于健康。啤酒產(chǎn)量居世界各種酒類之冠。目前全世界約有130個國家生產(chǎn)啤酒。世界人均年消費(fèi)啤酒約為

2、22 L左右，其中以德國和捷克等國家消耗水平最高，人均年消費(fèi)啤酒在160 L以上，約為世界平均消費(fèi)水平的8倍。英、美等發(fā)達(dá)國家也己經(jīng)達(dá)到了每人每年80 L。而作為世界第一人口大國的中國，人均年占有量僅為世界平均水平。因此，我國的啤酒尚有較大的市場空間?，F(xiàn)在，啤酒在世界許多地區(qū)正以他獨(dú)特的方式影響著人們的生活。 啤酒種類繁多，一般可根據(jù)生產(chǎn)方式，啤酒的濃度、色澤、消費(fèi)對象、包裝容器和發(fā)酵所用的酵母菌的種類等進(jìn)行分類。 根據(jù)色澤分類是啤酒最常見的分類方法，可分為三類：淡色啤酒，色度在514EBC (European Brewery Convention，歐洲釀造協(xié)會)單位；濃色啤酒，色度在1540

3、EBC單位；黑啤酒，色度大于40EBC單位。 根據(jù)啤酒是否殺菌或殺菌方式的不同，可將啤酒分為鮮啤酒、熟啤酒和生啤酒。鮮啤酒是指啤酒僅經(jīng)過一次粗過濾就進(jìn)行包裝，不經(jīng)過巴氏滅菌而銷售的啤酒，這類啤酒一般就地銷售，在低溫下保存時間一般為一周；熟啤酒是指啤酒灌裝后，經(jīng)過巴氏滅菌的啤酒，保存時間較長，可達(dá)三個月左右，有的可達(dá)到六個月；生啤酒是在生產(chǎn)工藝中不經(jīng)熱處理滅菌，主要采用微孔濾膜過濾的方法除去發(fā)酵液中的微生物，達(dá)到一定生物穩(wěn)定性的啤酒，這種啤酒能保持純正的啤酒自然發(fā)酵形成的風(fēng)味。按啤酒的包裝形式可分為瓶裝啤酒、桶裝啤酒和罐裝(聽裝)啤酒。瓶裝啤酒有玻璃瓶和PET瓶兩種，在容量上有350, 500,

4、 640毫升左右等幾種;罐裝啤酒有330,500毫升等規(guī)格。 按消費(fèi)對象可將啤酒分為普通型啤酒、無醇（或低醇)啤酒、無糖或低糖啤酒、酸啤酒等。無醇或低醇啤酒適于司機(jī)或不會飲酒的人飲用。無糖或低糖啤酒適宜于糖尿病患者飲用。按啤酒發(fā)酵所用的酵母菌在發(fā)酵過程中的沉降性質(zhì)和發(fā)酵的工藝類型，又可將啤酒分為上面啤酒和下面啤酒。啤酒釀造工藝流程 啤酒釀造的基本原料是發(fā)芽的大麥、水、酒花和啤酒酵母。其生產(chǎn)過程包括麥芽的制備，麥芽汁的制備，包括糖化、過濾、煮沸、澄清、冷卻，接種啤酒酵母進(jìn)行的啤酒發(fā)酵，發(fā)酵后進(jìn)行的過濾和澄清、滅菌、啤酒包裝等工序。啤酒的生產(chǎn)過程涉及到兩個主要的生物學(xué)變化過程麥芽制造和啤酒發(fā)酵。啤

5、酒釀造工藝流程如圖1所示。圖1 啤酒釀造工藝流程麥芽制備麥芽制備過程稱制麥，啤酒大麥經(jīng)清選、浸麥、發(fā)芽、烘干、焙燥、除根、包裝等，制成具有特定性質(zhì)的啤酒麥芽，其主要目的是將大麥、小麥等谷物原料通過種子的發(fā)芽過程，適度降解種子中的貯藏物質(zhì)，積累足夠量的酶類，并形成麥芽特定的風(fēng)味。大麥浸漬吸水后，在適宜的溫度和濕度下發(fā)芽，發(fā)芽時產(chǎn)生各種水解酶，如蛋白酶、糖化酶、一葡聚糖酶等，這些酶可將麥芽本身的蛋白質(zhì)分解成肽和氨基酸，將淀粉分解成糊精和麥芽糖等低分子物質(zhì)。發(fā)芽到一定程度，中止發(fā)芽得到綠麥芽，經(jīng)過排潮、烘干、焙燥得到成品麥芽。麥芽質(zhì)量的好壞是啤酒質(zhì)量好壞的基礎(chǔ)。麥汁制備是以麥芽為基料，將糊化后的大米

6、等淀粉質(zhì)輔料，與麥芽一同糖化，由麥芽中積累的酶類降解原料中的貯藏物質(zhì)，調(diào)節(jié)糖化麥芽汁的組成和狀態(tài)，加入酒花，經(jīng)過濾、沉淀、蒸發(fā)，再冷卻、充氧，形成具有一定濃度、特定的香氣和口味的定型麥芽汁，這既是啤酒酵母發(fā)酵的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，也是啤酒成品的原料。麥芽經(jīng)適當(dāng)粉碎，加入溫水，在一定的溫度下，利用麥芽本身的酶或外加酶制劑進(jìn)行糖化，主要將麥芽及輔料中的淀粉及蛋白質(zhì)等水解成麥芽糖和氨基酸，便于酵母利用。為了降低生產(chǎn)成本，還可以加入一定比例的大米作輔料，大米需要先粉碎加水煮沸糊化。糖化醪用過濾槽進(jìn)行過濾，得到麥芽汁，將麥芽汁輸送到麥汁煮沸鍋中，加入酒花煮沸，蒸發(fā)多余的水分。酒花是一種稱為蛇麻或忽布的植物的雌花

7、，加入到啤酒中，可使啤酒帶有特有的柔和優(yōu)美的酒花芳香和爽口的微苦味，能加速麥汁中高分子蛋白質(zhì)的絮凝，提高啤酒的起泡性和泡持性，同時，酒花中的一些成份還能抑制某些微生物的生長，增加麥汁和啤酒的生物穩(wěn)定性，延長啤酒的保質(zhì)期。啤酒酵母種子的制備 將啤酒酵母經(jīng)三角瓶、卡氏罐、漢生罐、酒母罐到種子罐的逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，得到足夠量的啤酒酵母種子液，接種到定型麥芽汁中就啟動了啤酒發(fā)酵的過程，或者直接使用啤酒發(fā)酵沉淀的酵母泥經(jīng)一定的處理后接種發(fā)酵。啤酒發(fā)酵 啤酒發(fā)酵過程分為主發(fā)酵和后酵貯酒兩個階段。發(fā)酵結(jié)束后再進(jìn)行發(fā)酵后期的澄清、過濾、包裝、滅(除)菌，得到啤酒的成品。啤酒發(fā)酵生產(chǎn)中酵母是啤酒質(zhì)量控制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)

8、的啤酒根據(jù)菌種的沉降性質(zhì)和發(fā)酵工藝不同，分為下面發(fā)酵和上面發(fā)酵啤酒兩種類型，國內(nèi)啤酒的主流工藝類型為下面發(fā)酵啤酒類型，我們平時所說的啤酒發(fā)酵也特指下面發(fā)酵。其工藝特點(diǎn)是:采用下面酵母，主發(fā)酵溫度比較低，發(fā)酵進(jìn)程比較緩慢，發(fā)酵的代謝副產(chǎn)物相對較少。主發(fā)酵完畢后，大部分酵母沉降發(fā)酵容器底部，其后發(fā)酵和貯酒期比較長，酒液澄清良好，CO2飽和穩(wěn)定，酒的泡沫細(xì)微，風(fēng)味柔和，保存期較長。（1）主發(fā)酵 在主發(fā)酵期間啤酒酵母將麥芽汁中的糖分轉(zhuǎn)化為啤酒發(fā)酵的主要產(chǎn)物乙醇和二氧化碳，并產(chǎn)生一定的風(fēng)味物質(zhì)副產(chǎn)物，如揮發(fā)性醛類、醇類、羰基化合物、酸類、酚基化合物及含硫化合物等，作為啤酒風(fēng)味的基礎(chǔ)物質(zhì)，這一過程通常需要

9、發(fā)酵溫度控制在610，持續(xù)710天。主發(fā)酵前期為酵母繁殖階段，啤酒酵母利用麥芽汁中糖類和氨基酸等營養(yǎng)原料，以及麥汁中的溶解氧，合成酵母細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行繁殖。此階段發(fā)酵液降糖較慢，-氨基氮迅速被同化，酵母細(xì)胞數(shù)逐步上升。當(dāng)溶解氧消耗完以后，就進(jìn)入發(fā)酵階段。這一階段糖濃度下降較快，麥汁中的糖類(主要是麥芽糖)被轉(zhuǎn)化為酒精，同時發(fā)酵液溫度上升，需進(jìn)行冷卻。（2）后發(fā)酵及貯酒 后發(fā)酵貯酒通常是在約0的低溫條件下貯存310周，完成殘?zhí)前l(fā)酵、去除凝固物、飽和CO2、提高啤酒膠體穩(wěn)定性以及促進(jìn)啤酒風(fēng)味成熟。由于啤酒生產(chǎn)的后發(fā)酵期在啤酒的整個釀造過程中生產(chǎn)期最長，因而是提高啤酒生產(chǎn)效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？s短啤酒生產(chǎn)的后

10、發(fā)酵期，可以縮短啤酒發(fā)酵生產(chǎn)周期，從而節(jié)約巨大的貯存容積，提高設(shè)備利用率；同時還可以節(jié)省冷凍容量，降低產(chǎn)品的能源消耗，最終降低啤酒成本。在傳統(tǒng)啤酒生產(chǎn)的后酵中，隨著時間的延長，啤酒中殘留的糖份逐漸被啤酒酵母發(fā)酵完全，啤酒逐步被二氧化碳飽和，酵母、冷凝固形物及酒花樹脂等在低溫和適當(dāng)pH值下緩慢沉淀，酒液逐漸澄清，同時發(fā)酵液中的風(fēng)味成分液逐步改變，形成特定的風(fēng)味體系，啤酒逐漸成熟。在后酵成熟中可以采用人工充二氧化碳，離心分離酵母，添加非生物穩(wěn)定劑(硅膠、單寧酸、蛋白酶等)吸附沉淀及分解高分子蛋白質(zhì)和多酚物質(zhì)等多種成熟工藝方法，縮短發(fā)酵作用時間，達(dá)到后酵貯酒的目的。發(fā)酵工藝控制發(fā)酵過程的工藝控制也是

11、啤酒發(fā)酵的主要技術(shù)因素。主要有發(fā)酵溫度、發(fā)酵罐壓力、酵母分離時間和方法、酵母懸浮細(xì)胞密度、后發(fā)酵貯酒的條件和時間等。其中發(fā)酵溫度最為重要，一般啤酒發(fā)酵溫度宜采用較低溫度發(fā)酵，下面啤酒為712，可以防止或減少細(xì)菌的污染，減少代謝副產(chǎn)物的生成，有利于啤酒風(fēng)味的形成，主發(fā)酵溫度的不同也顯著地影響啤酒的風(fēng)格。發(fā)酵罐壓力及C02濃度對發(fā)酵影響也較大。發(fā)酵罐壓力通常是由于發(fā)酵中產(chǎn)生的CO2保壓形成的，因此CO2的濃度隨壓力的增加而增加，造成酵母增殖減少，發(fā)酵遲緩，代謝副產(chǎn)物也減少。另外發(fā)酵其它工藝條件對啤酒發(fā)酵也有較大的影響。菌株的選擇和使用發(fā)酵菌株的特性將深刻地影響到微生物發(fā)酵過程的多個方面。對啤酒發(fā)酵

12、也是一樣，菌株特性影響著酵母對糖的利用、氨基酸的同化、主產(chǎn)物酒精的發(fā)酵、副產(chǎn)物的形成、啤酒風(fēng)味的成熟以及啤酒的穩(wěn)定性等。同時還要考慮菌株特性對發(fā)酵過程控制操作最有利。啤酒酵母特性需要注意酵母的發(fā)酵速度、發(fā)酵限度、凝聚性、回收性以及穩(wěn)定性等。在菌種的使用上要根據(jù)菌種的特性制定擴(kuò)大培養(yǎng)工藝，以保證發(fā)揮最大作用：啤酒酵母的接種量也要適當(dāng)提高，接種量高發(fā)酵速度快，發(fā)酵終了時新增酵母細(xì)胞少，副產(chǎn)物雙乙酞峰值低，高級醇生成也少，對啤酒發(fā)酵整體有利，但接種量過高也會導(dǎo)致發(fā)酵后期酵母活力下降，后發(fā)酵不徹底，造成啤酒品質(zhì)下降。世界啤酒工業(yè)總的發(fā)展趨勢是擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，采用大容量發(fā)酵罐;從工藝入手，縮短生產(chǎn)周期。從

13、啤酒發(fā)酵機(jī)理出發(fā)，在接近主酵完成之時，提高發(fā)酵溫度，加速了雙乙酞的還原和啤酒的成熟，因?yàn)殡p乙酰還原是啤酒成熟和縮短酒齡的關(guān)鍵，從而大大縮短了生產(chǎn)時間;設(shè)計(jì)并采用了多種型式的大容量發(fā)酵罐;采用一罐發(fā)酵，簡化生產(chǎn)工序，主酵和后酵不再嚴(yán)格區(qū)分，縮短生產(chǎn)時間;研究固定化酵母發(fā)酵技術(shù)，采用連續(xù)發(fā)酵，是目前啤酒發(fā)酵技術(shù)的最大特點(diǎn)。麥汁緩沖性是指麥汁在其pH值范圍內(nèi)具有一定的緩沖能力。麥汁緩沖容量是衡量麥汁緩沖能力大小的尺度。許多研究證實(shí)，從麥汁到啤酒這個過程中，雖然緩沖體系的主要緩沖物質(zhì)發(fā)生了變化，但是整個緩沖體系的緩沖容量保持相對不變，因此，麥汁的緩沖性與啤酒的緩沖性息息相關(guān);從另一種角度講，麥汁這種緩

14、沖性在一定程度上，決定了成品啤酒pH值并控制著成品啤酒pH值的變化幅度。啤酒品質(zhì)及其控制技術(shù) 啤酒是一種飲料酒，同時也是一種營養(yǎng)食品。各國對啤酒的需要量很大，而且出現(xiàn)不斷增長的趨勢。中國是世界啤酒生產(chǎn)消費(fèi)第一大國，隨著啤酒行業(yè)的發(fā)展以及人們生活水平的提高，人們對啤酒提出了更高的要求，包括啤酒的衛(wèi)生要求、風(fēng)味品質(zhì)、質(zhì)量指標(biāo)、外觀包裝等多個方面。啤酒麥汁沒有令人愉快的風(fēng)味，只有通過啤酒酵母的發(fā)酵產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，才能構(gòu)成啤酒特有的香味和口味。主要代謝產(chǎn)物是乙醇、CO2和水，高級醇則是酵母發(fā)酵主要副產(chǎn)物，它和雙乙酰對啤酒風(fēng)味影響較大。啤酒中的高級醇也稱為雜醇油是構(gòu)成啤酒酒體的重要物質(zhì)，是啤酒的風(fēng)

15、味成分之一。啤酒中高級醇類主要有異戊醇、異丁醇、活性戊醇、一苯乙醇、正丙醇等。適宜的含量，會給人以醇厚、豐滿之感，飲后有愉快的感覺。但如果含量偏高，就會造成相反的結(jié)果，不但會給啤酒帶來不愉快的后苦味，還會令飲者有“上頭”的感覺。據(jù)有關(guān)規(guī)定資料介紹，如果以對人體交感神經(jīng)、視覺神經(jīng)等大腦細(xì)胞傷害程度的大小將乙醇對人體的毒性定為1，那么異丁醇為8，異戊醇為19，而異戊醇在啤酒高級醇中的含量最高，約占50%，可見高級醇比乙醇對人的傷害更大。己經(jīng)證實(shí)飲啤酒上頭是由于高級醇含量過高引起的。因此，控制啤酒中高級醇的含量對提高啤酒質(zhì)量，改善啤酒風(fēng)味有著十分重要的意義。啤酒成熟的標(biāo)準(zhǔn)是純正、爽口，無異雜味。它的

16、風(fēng)味成分主要來源于啤酒的原料大麥芽及其它谷物輔料、酒花和酵母的發(fā)酵作用，其中，起重要風(fēng)味作用的主要是雙乙酰（diacetyl)。雙乙酰及戊二酮的閾值因啤酒的種類而不同，下面發(fā)酵啤酒中的閾值低于上面發(fā)酵啤酒。某種風(fēng)味物質(zhì)“閾值”是指該風(fēng)味成分能夠被人感覺到的最低濃度。一般說，在發(fā)酵啤酒中雙乙酰的閾值是0.1 mg/L。當(dāng)雙乙酰在啤酒中的濃度超過閾值時，會產(chǎn)生一種令人不愉快的餿酸味(雙乙酰味)，從而破壞了啤酒的風(fēng)味，影響啤酒的質(zhì)量。由于雙乙酰的產(chǎn)生與還原貫穿整個啤酒發(fā)酵過程，其含量已成為啤酒發(fā)酵成熟與否的標(biāo)志。啤酒酵母（S.cerevisiae Hansen）它在麥汁中25培養(yǎng)三天，細(xì)胞為圓形、卵

17、形、橢圓形到臘腸形.按細(xì)胞長與寬之比又可分為三組。第一組細(xì)胞長寬比為12（<2）細(xì)胞為圓形或卵形。此組根據(jù)細(xì)胞大小又可分成大、中、小三型。此組酵母主要用于酒精（淀粉質(zhì)原料）和白酒等蒸餾酒的生產(chǎn)，其中如德國2號、德國12號（Rasse .Rasse ）,應(yīng)用極為廣泛。這組還包括了葡萄酒酵母和魏氏酵母。第二組長寬比為1：2，以長卵形為主。此組酵母細(xì)胞出芽長大后不脫落，再出芽，易形成芽簇-假菌絲。主要用于啤酒、果酒釀造和面包發(fā)酵。第三組長寬比>2,細(xì)胞為長圓形至臘腸形,此類酵母耐高滲透壓,用于糖蜜酒精和朗姆酒生產(chǎn),臺灣396號酵母即屬此組。典型的啤酒酵母短軸與長軸之比為1：（10）.而且

18、大多數(shù)優(yōu)良菌株在1：（）之間.細(xì)胞拉長是變異的結(jié)果或發(fā)酵后期營養(yǎng)不足造成的。在液體培養(yǎng)時，細(xì)胞是單個的或有一個子細(xì)胞，子細(xì)胞為母細(xì)胞2/3體積即脫落。細(xì)胞大小 ：細(xì)胞可以分成兩類，大型細(xì)胞尺寸為（）×（）µm,體積大于176µm³中小型()×() µm,體積100160µm³。中、小型酵母雖有的凝聚性很好，但大多數(shù)不如大型的。不過在相同的接種量下，中小型細(xì)胞比表面積大，發(fā)酵速度較快。近幾年人們傾向于挑選中小型細(xì)胞的菌株。本研究介紹一種較為先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法響應(yīng)面分析法RSA (Response SurfaceAna

19、lysis) 。RSA 方法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具,將多因子試驗(yàn)中因素與試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系用多項(xiàng)式近似,把因子與試驗(yàn)結(jié)果(響應(yīng)值) 的關(guān)系函數(shù)化,依次可對函數(shù)進(jìn)行面分析,定量地分析各因素及彼此之間交互作用對響應(yīng)值的影響。由于采用了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),能以最經(jīng)濟(jì)的方式,用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時間對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究,科學(xué)地提供局部與整體的關(guān)系,從而取得明確的、有目的的結(jié)論,故近年來越來越為食品界科技人員所重視。啤酒釀造就是酵母將麥汁中的糖分發(fā)酵成乙醇和二氧化碳的過程。在這個轉(zhuǎn)變過程中，酵母發(fā)揮了極其重要的作用，同時形成了對啤酒的口味、香味及其它特性有重要影響的發(fā)酵副產(chǎn)物，不同的酵母和發(fā)酵工藝對啤酒的口味

20、特點(diǎn)起決定性的作用。同時，我們還發(fā)現(xiàn)同一酵母菌在不同的啤酒生產(chǎn)廠表現(xiàn)出不同的特性，這說明環(huán)境因素的不同會引起酵母基因表達(dá)的變化，因此采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了四因素三水平的發(fā)酵參數(shù)實(shí)驗(yàn)，用以確定合適的發(fā)酵條件，發(fā)揮每一株酵母的最佳性能，確保發(fā)酵過程的穩(wěn)定性和一致性，從而進(jìn)一步保證啤酒質(zhì)量的一致性。1.8 研究方案去生產(chǎn)廠取麥汁，然后根據(jù)要求調(diào)配，經(jīng)過酵母發(fā)酵后測定發(fā)酵液關(guān)鍵性指標(biāo)，最后用Design-Expert軟件分析，方案如下：麥芽汁調(diào)配發(fā)酵檢測Design-Expert軟件分析本研究介紹一種較為先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法響應(yīng)面分析法RSA(Response SurfaceAnalysis) 。RSA

21、方法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具,將多因子試驗(yàn)中因素與試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系用多項(xiàng)式近似,把因子與試驗(yàn)結(jié)果(響應(yīng)值) 的關(guān)系函數(shù)化,依次可對函數(shù)進(jìn)行面分析,定量地分析各因素及彼此之間交互作用對響應(yīng)值的影響。由于采用了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),能以最經(jīng)濟(jì)的方式,用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時間對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究,科學(xué)地提供局部與整體的關(guān)系,從而取得明確的、有目的的結(jié)論,故近年來越來越為食品界科技人員所重視。啤酒釀造就是酵母將麥汁中的糖分發(fā)酵成乙醇和二氧化碳的過程。在這個轉(zhuǎn)變過程中，酵母發(fā)揮了極其重要的作用，同時形成了對啤酒的口味、香味及其它特性有重要影響的發(fā)酵副產(chǎn)物，不同的酵母和發(fā)酵工藝對啤酒的口味特點(diǎn)起決定性的作用。同時

22、，我們還發(fā)現(xiàn)同一酵母菌在不同的啤酒生產(chǎn)廠表現(xiàn)出不同的特性，這說明環(huán)境因素的不同會引起酵母基因表達(dá)的變化，因此采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了四因素三水平的發(fā)酵參數(shù)實(shí)驗(yàn)，用以確定合適的發(fā)酵條件，發(fā)揮每一株酵母的最佳性能，確保發(fā)酵過程的穩(wěn)定性和一致性，從而進(jìn)一步保證啤酒質(zhì)量的一致性。材料與方法麥汁、嶗啤酵母（圖2）、青啤酵母（圖3）、糖漿、氧氣、硫酸鋅等。圖2嶗啤酵母圖3青啤酵母Z1 Counter® Particle Counter計(jì)數(shù)儀HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱REVCO生化培養(yǎng)箱Lambda 2S分光光度計(jì)VX100型混勻器ANTON PAAR啤酒分析儀 APS-2HYPERSIL NH2

23、 柱2695型高效液相色譜分離單元Waters 2414示差折光檢測器250mL發(fā)酵管（2cm×）4080 SHINVA®滅菌鍋DELTA 320 PH計(jì)Milli-QPlus純水制備儀HZQ-F160 HDL®全溫振蕩培養(yǎng)箱CB150 WTB BINDER生化培養(yǎng)箱WBG-0-2 二等標(biāo)準(zhǔn)汞溫度計(jì)Clarus 500氣相色譜儀DB-5 色譜柱3K15型低溫高速離心機(jī)美國BECKMAN COUNTER公司哈爾濱東聯(lián)公司美國REVCO公司美國PERKIN ELMER公司美國LABNET公司奧地利ANTON PAAR公司美國THERMO公司美國WATERS公司美國WA

24、TERS公司青島海洋大學(xué)玻璃儀器廠定制山東新華醫(yī)療器械股份有限公司 瑞士METTLER TOLEDO公司美國MILLIPORE公司哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 德國WTB BINDER公司上海華辰醫(yī)用儀器有限公司美國PERKIN ELMER公司美國AGILENT公司德國SIGMA公司酵母計(jì)數(shù)儀的使用由于測量時取樣是200l，加入酵母計(jì)數(shù)儀的燒杯中，燒杯內(nèi)裝有100ml離子水，所以計(jì)算測量結(jié)果時需要將酵母計(jì)數(shù)儀上顯示的數(shù)據(jù)乘以500才是真正結(jié)果。在測量之前要放入空白離子水校正酵母計(jì)數(shù)儀，使其測量結(jié)果在顯示屏上顯示在300以下最后，這樣測量的結(jié)果才比較準(zhǔn)確。測量結(jié)束后要將酵母計(jì)數(shù)儀循環(huán)12次防止

25、酵母或大的其他粒子堵住計(jì)數(shù)儀上的計(jì)數(shù)管上的小孔。酵母的添加根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算出需要加入的擴(kuò)培酵母的量，放入50ml離心管中，放入3K15型低溫高速離心機(jī)中用4000r/min離心5min，然后將離心后的酵母泥加入SCHOOT瓶中。不同糖度麥汁制備從青島啤酒四廠發(fā)酵車間取未充氧麥汁30L，帶回青島啤酒科研所待測。用糖度計(jì)測量所取麥汁為13度麥汁，實(shí)驗(yàn)要求所需培養(yǎng)基為13度，15度和18度。13度麥汁需要 L，15度麥汁需要L，18度麥汁需要L。15度麥汁用13度麥汁加一定量的75度糖漿配制，18度麥汁同樣如此。添加糖精的計(jì)算方法：15度的計(jì)算方法8500×0.15(8500-X)

26、5;0.13+X×18度的計(jì)算方法3500×0.18(3500-X)×0.13+X×0.75 分別計(jì)算得出15度需要13度麥汁8226ml，糖精274ml,18度需要13度麥汁3218ml，糖精282ml.15度麥汁的配置：用1L量筒取8226ml麥汁分別放入兩個5L的三角瓶中，然后用250ml量筒取250ml糖精倒入其中一個三角瓶中，用三角瓶中的麥汁沖洗量筒，再用50ml量筒取24ml糖精倒入同一個三角瓶，同樣用三角瓶中的麥汁沖洗干凈，然后將另一個三角瓶中的麥汁與這個三角瓶中的麥汁混勻?；靹蚝笥?0度糖度計(jì)校正所配麥汁，適量加減麥汁或糖精。18度麥汁的

27、配置：用1L量筒取3218ml13度麥汁放入5L三角瓶中，再分別用250ml和50ml量筒取282ml糖精加入三角瓶中，用三角瓶中的麥汁反復(fù)沖洗量筒將麥汁混勻。混勻后用20度糖度計(jì)校正所配麥汁，適量加減麥汁或糖精。不同鋅離子量麥汁制備根據(jù)鋅離子量再將三種麥汁分別配置成0.15ppm，0.35ppm，0.5ppm。由于麥汁中鋅離子含量為0.15ppm，所以只需配0.35ppm，0.5ppm。首先用電子稱取ZnSO4.7H2O ，放入裝有1L蒸餾水的燒杯中，配置成鋅離子為100ppm的溶液待用。13度麥汁鋅離子含量為0.15ppm需要500ml，0.35ppm需要2000ml，0.5ppm需要50

28、0ml。15麥汁鋅離子含量為0.15ppm需要2000ml，0.35ppm需要4000ml，0.5ppm需要2000ml。18度麥汁鋅離子含量為0.15ppm需要500ml，0.35ppm需要2000ml，0.5ppm需要500ml。13度麥汁鋅離子含量為0.35ppm需要100ppm溶液量的計(jì)算方法：2000×0.35（2000-X）×0.15+X×100，計(jì)算得出需要100ppm溶液4ml。0.5ppm需要100ppm溶液量的計(jì)算方法：500×0.5（500-X）×0.15+X×100得出需要100ppm溶液1.75ml。15度麥

29、汁鋅離子含量為0.35ppm需要量的計(jì)算方法：4000×0.35（4000-X）×0.15+X××0.5（2000-X）×0.15+X×100得出需要100ppm溶液7ml。用同樣的計(jì)算方法得出18度麥汁鋅離子含量為0.35ppm需要100ppm溶液溶液4ml，0.5ppm需要100ppm溶液1.75ml。取13度麥汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取4ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麥汁。再取13度麥汁500ml放入1L三角瓶中，用200ul移液器取1.75ml100ppm溶液放入三角瓶中，配置成

30、0.5ppm麥汁。分別貼上標(biāo)簽。取15度麥汁4000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取8ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麥汁。再取15度麥汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取7ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.5ppm麥汁。分別貼上標(biāo)簽。取18度麥汁2000ml放入5L三角瓶中，用5ml移液器取4ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.35ppm麥汁。再取18度麥汁500ml放入1L三角瓶中，用200l移液器取1.75ml 100ppm溶液放入三角瓶中，配置成0.5ppm麥汁。分別貼上標(biāo)簽。充氧方式本次實(shí)驗(yàn)充氧分為充氧8ppm，11pp

31、m，和14ppm三種充氧量。充氧在SCHOTT DURAN瓶中進(jìn)行。8ppm的充氧：先用手用力來回?fù)u晃共四十下，過一段時間再搖晃四十下，共搖晃三次。11ppm的充氧：用氧氣瓶往SCHOTT DURAN瓶中沖入氧氣約20秒后，蓋上瓶蓋，用力來回?fù)u晃共四十下，如此再進(jìn)行兩次。14ppm的充氧：用氧氣瓶往SCHOTT DURAN瓶中沖入氧氣約20秒后，蓋上瓶蓋，用力來回?fù)u晃共四十下，如此再進(jìn)行兩次。然后將輸氧管插入培養(yǎng)麥汁中充氧約20秒，蓋上瓶蓋，用力來回?fù)u晃共四十下。酵母的測量用注射器從發(fā)酵管中抽取5ml左右培養(yǎng)液，抽取時要先抽取1ml左右，然后將抽取物放掉，再抽取5ml，這樣抽取的培養(yǎng)液比較均勻

32、。然后將抽取的培養(yǎng)液放入10ml離心管中，用微型漩渦振蕩儀振蕩均勻，再用酵母計(jì)數(shù)儀測量出酵母數(shù)。發(fā)酵度測定將發(fā)酵管中的培養(yǎng)液倒出用過雙層濾紙過濾，取25ml左右，用啤酒分析儀測量發(fā)酵度。成熟度檢測將培養(yǎng)液用雙層濾紙過濾后，用高效氣相、液相檢測。第一階段將配好的麥汁按照表1所示分裝在SDHOOT瓶中，每瓶裝240ml，再按如表2、表3所示添加青啤酵母或嶗啤酵母，進(jìn)行充氧。最后裝入發(fā)酵管中，按表所示時間測量酵母數(shù)。待第七天后將發(fā)酵管中的培養(yǎng)液倒出過濾測量發(fā)酵度、成熟度。第二階段除添加酵母為嶗啤酵母外，其余操作與第一階段相同。通過文獻(xiàn)及以往實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，酵母添加量、充氧量、鋅離子含量、麥汁濃度和發(fā)酵溫度

33、是影響酵母發(fā)酵的關(guān)鍵因素，因此，在此基礎(chǔ)上，本研究采用Box-Behnken模型，以酵母添加量、充氧量、鋅離子含量和麥汁濃度4個外界因子為自變量（independent variable），分別以X1、X2、X3、X4來表示之，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程xi=(Xi-X0)/X對自變量進(jìn)行編碼，其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，X為自變量的變化步長。衡量發(fā)酵性能采用五個指標(biāo)麥芽三糖利用量、發(fā)酵度、成熟度（雙乙酰、戊二酮、乙醛）作為響應(yīng)值Y1-Y5,因子編碼及水平見表1。利用統(tǒng)計(jì)軟件DesignExpert(Stat

34、icMadeEasy,Minneapolis,MN,USA)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。表1各因素量及水平自變量水平麥汁濃度/0P充氧量/ppm鋅離子含量/ppm酵母添加量/（×106個/ml）-11381501511201181425實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法：響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)里的BOX-Benhnken采用的設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析軟件：Design-Expert設(shè)計(jì)原理：以發(fā)酵度、成熟度等指標(biāo)作為因變量y，麥汁濃度、充氧等因素作為自變量x，通過少量有代表性的實(shí)驗(yàn)將y與x之間的關(guān)系函數(shù)化，從而可以量化它們之間的關(guān)系，預(yù)測出最佳發(fā)酵參數(shù)，并找出因素之間的相互影響趨勢。實(shí)驗(yàn)安排：2株酵母、1種溫度共54次實(shí)驗(yàn)，

35、實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，表3。其中成熟度（乙醛，戊二酮，雙乙酰）為第七天測，酵母數(shù)為第一天，第三天，第五天，第七天所測。表2為青啤酵母實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果，表3為嶗啤酵母實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果。3 結(jié)果與討論3.1 結(jié)果試驗(yàn)所得結(jié)果如表2表3所示表2青啤酵母實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果麥汁濃度/0P酵母添加/（×106個/ml）麥汁充氧/ppm麥汁鋅/ppm麥芽三糖含量/（g/L）麥芽三糖含量/（g/L）利用量/（g/L）發(fā)酵度/（%）雙乙酰/ppb戊二酮/ppb乙醛/ppb第1天酵母數(shù)/（×106個/ml）第3天酵母數(shù)/（×106個/ml）第5天酵母數(shù)/（×106個/ml）第7天酵

36、母數(shù)/（×106個/ml）1320148.99 20.0 1315118.61 64.5 16.6 1325118.43 42.9 31.0 1320119.59 56.7 20.0 1320118.73 40.3 22.0 132088.28 44.3 23.0 152581525111520146.85 153.9 27.0 1515118.95 108.4 16.0 1525149.32 102.0 43.8 1525118.30 121.3 39.1 1520118.38 132.9 32.3 1520119.19 106.2 43.3 1520118.36 90.4 42.

37、0 1520147.70 73.9 30.9 1515148.23 185.7 25.4 152088.43 146.5 31.3 151588.25 253.5 26.7 1515117.92 319.2 23.6 152088.11 102.8 35.1 18251111.44 122.0 37.1 18201112.24 148.0 23.8 18201112.32 119.0 25.2 1820811.09 232.0 28.3 18201410.16 154.0 24.5 18151112.24 161.0 920.2 表3嶗啤酵母實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果麥汁濃度/0P酵母添加/（×

38、106個/ml）麥汁充氧/ppm麥汁鋅/ppm麥芽三糖含量/（g/L）麥芽三糖含量/（g/L）利用量/（g/L）發(fā)酵度/（%）雙乙酰/ppb戊二酮/ ppb乙醛/ppb第1天酵母數(shù)/（×106個/ml）第3天酵母數(shù)/（×106個/ml）第5天酵母數(shù)/（×106個/ml）第7天酵母數(shù)/（×106個/ml）1320141.20 10.5 3.84 20.0 148.0 32.4 1315111.54 30.5 3.88 21.0 83.0 7.1 1325111.00 7.1 3.28 19.0 116.0 11.1 1320110.99 8.8 3.44

39、25.0 102.0 15.6 1320111.44 9.5 4.14 23.0 105.6 28.8 132081.12 22.8.0 3.46 23.6 137.0 9.6 152582.29 63.5 35.7 5.10 28.0 114.0 35.7 1525111.68 60.9 31.0 5.29 44.6 107.8 5.5 1520142.39 90.0 50.0 5.13 22.0 88.8 1.1 1515112.22 84.6 45.7 5.08 16.0 99.0 31.9 1525142.25 52.5 27.3 5.77 28.0 106.8 12.6 152511

40、2.09 99.4 42.2 5.85 36.2 95.2 5.0 1520111.59 98.6 49.2 6.02 33.1 197.3 19.6 1520111.61 115.3 55.5 4.12 33.0 96.4 60.1 1520111.73 81.2 44.0 6.25 34.9 91.2 11.0 1520144.87 157.0 77.0 6.44 26.5 94.4 14.0 1515145.69 221.0 99.9 8.54 20.4 88.9 13.4 152084.62 167.0 98.0 6.10 29.2 91.2 13.5 151585.91 182.0

41、99.0 8.55 19.4 92.2 14.0 1515115.60 285.0 158.0 9.33 17.3 67.0 13.8 152084.78 169.0 89.0 5.78 24.9 92.4 16.1 1825116.97 464.0 200.0 7.57 33.5 90.6 13.1 1820118.14 359.0 167.0 8.19 25.8 88.7 27.1 1820117.89 343.0 179.0 8.69 23.4 73.8 19.4 182088.95 381.0 190.0 8.69 25.8 81.3 40.4 1820149.84 444.0 190

42、.0 8.37 25.1 80.7 40.9 1815113.2對發(fā)酵度的分析根據(jù)表2，表3中數(shù)據(jù)，采用Design-Expert軟件對青啤酵母和嶗啤酵母發(fā)酵度情況進(jìn)行圖示分析如圖4和圖5所示。以下所有圖中A代表麥汁濃度，B代表酵母添加量，C代表麥汁充氧量，D代表麥汁鋅含量。圖4青啤酵母發(fā)酵度情況圖5嶗啤酵母發(fā)酵度情況相同點(diǎn)：對于兩株酵母來說，麥汁濃度都是影響發(fā)酵度最大的因素。不同點(diǎn)：對于青啤酵母，4個因素對于發(fā)酵度的影響都是線形的，隨著水平由低到高，對于發(fā)酵度來說都是負(fù)面影響，影響因素最大的是麥汁濃度，其它因素的影響力度都比較小；對于嶗啤酵母，除了麥汁鋅，其它三個因素對于發(fā)酵度都有影響，并且

43、是非線性的，在從低水平到中水平，增大酵母添加和麥汁充氧有利于發(fā)酵度的增大，但隨著麥汁濃度的增高，酵母添加量對發(fā)酵度的影響越來越小，麥汁充氧此時變大反而不利于發(fā)酵度。3.3對麥芽三糖利用量的分析圖6青啤酵母麥芽三糖利用量情況圖7嶗啤酵母麥芽三糖利用量情況同樣根據(jù)表2，表3中數(shù)據(jù)，對兩株酵母對麥芽三糖的利用率進(jìn)行分析如圖6和圖7所示。青啤酵母：麥汁濃度對于麥芽三糖的利用量影響非常大，隨著麥汁濃度的增大，酵母利用的麥芽三糖越來越多。酵母添加和鋅離子對此幾乎沒有影響，從低水平到中水平，增大充氧量有利于麥芽三糖的利用，從中水平到高水平，再增大充氧量反而不利于利用麥芽三糖的利用。嶗啤酵母：麥汁濃度對于麥芽

44、三糖的利用反而影響不大，此時另外三個因素的影響程度都是非線性的，酵母添加對于麥芽三糖利用量始終是正面影響，不過影響幅度是逐漸變小的。麥汁充氧和麥汁鋅都是從低-中是正面影響，從中-高水平是負(fù)面影響。結(jié)論：嶗啤酵母利用麥芽三糖的能力比青啤酵母強(qiáng)很多，在不同濃度的麥汁只要調(diào)整好其它參數(shù)，都有一定的利用能力。3.4對雙乙酰的分析根據(jù)表2，表3中數(shù)據(jù)，對兩株酵母雙乙酰情況進(jìn)行分析如圖8和圖9所示。圖8青啤酵母雙乙酰含量情況圖9嶗啤酵母雙乙酰含量情況兩株酵母中四個因素對于雙乙酰的影響趨勢大體相同，但幅度不同。麥汁濃度對于雙乙酰的影響在嶗啤酵母中更強(qiáng)一些，隨著麥汁濃度的增大，雙乙酰升高的很快，在接近18度時

45、，麥汁濃度再增大，雙乙酰值不再上升。同樣的7天發(fā)酵周期，青啤酵母雙乙?？傮w水平要比嶗啤酵母高，這說明其還原雙乙酰要慢一些。3.5對戊二酮的分析根據(jù)表2，表3中數(shù)據(jù)，對兩株酵母戊二酮情況進(jìn)行分析如圖10和圖11所示。圖10青啤酵母戊二酮含量情況圖11嶗啤酵母戊二酮含量情況與雙乙酰的變化趨勢基本一致。嶗啤酵母的戊二酮總體值都比青啤酵母要低。根據(jù)表2，表3中數(shù)據(jù)，對兩株酵母乙醛情況進(jìn)行分析如圖12和圖13所示。四個因素對嶗啤酵母乙醛生成量的影響程度與其對雙乙酰、戊二酮的影響基本一致。青啤酵母稍有改變，從低水平到中水平，麥汁濃度越高，乙醛輛越高，從中水平到高水平，麥汁濃度再變大，乙醛量反而變小。圖12

46、 青啤酵母乙醛含量情況圖13 嶗啤酵母乙醛含量情況3.7交互作用-因素之間的互相影響根據(jù)表2和表3的數(shù)據(jù)對幾個因素之間的交互作用進(jìn)行分析如圖14，15，16所示。三個圖x軸都是鋅離子濃度從小到大，y軸分別是發(fā)酵度、麥芽三糖利用率和乙醛。紅色線代表酵母添加為25×106個/ml時隨著麥汁鋅增大，y值的變化趨勢；黑色線代表酵母添加為15×106個/ml時隨著麥汁鋅增大，y值的變化趨勢。這三個圖都是酵母添加量少15×106個/ml的話，增加鋅離子起負(fù)作用，酵母添加量多25×106個/ml，增加鋅離子其正作用。這就說明鋅離子和酵母添加量這兩個因素必須同時考慮，不考慮酵母添加量而僅僅增大或者減小鋅離子量對于發(fā)酵的影響是不確定的。想要添加合適的酵母數(shù)，必須給搭配相應(yīng)