細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定

1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)6 6 細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定細(xì)胞核的分離與核酸的鑒定（Separation of cell nuclei and identification of nucleic acids） 遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室 朱朱 欣欣 婷婷 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1.1.掌握離心技術(shù)的原理及離心機(jī)的使用；掌握離心技術(shù)的原理及離心機(jī)的使用；2.2.熟悉提取分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的方法；熟悉提取分離細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)的方法；3.3.熟悉鑒定核酸的方法；熟悉鑒定核酸的方法； 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷一、核酸的種類及其分布一、核酸的種類及其分布請思考？請思考？ DNA、

2、RNA在細(xì)胞中的分布：在細(xì)胞中的分布：DNA胞核內(nèi)胞核內(nèi)(98%)胞質(zhì)內(nèi)胞質(zhì)內(nèi)(2%)RNA胞核內(nèi)胞核內(nèi)(10%)胞質(zhì)內(nèi)胞質(zhì)內(nèi)(90%) 核酸的種類：核酸的種類： DNA、RNA結(jié)論：結(jié)論：DNA主要存在于細(xì)胞核，主要存在于細(xì)胞核， RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)。主要存在于細(xì)胞質(zhì)。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷二、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核二、分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核 . .破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞細(xì)胞破碎的方法細(xì)胞破碎的方法機(jī)械法機(jī)械法高速組織搗碎機(jī)高速組織搗碎機(jī)玻璃勻漿器玻璃勻漿器研缽研缽物理法物理法超聲勻漿器超聲勻漿器凍融法凍融法化學(xué)法化學(xué)法自溶法自溶法酶處理酶處理表面活性劑處理法表面活性劑處理法 生化教研室

3、生化教研室 朱欣婷朱欣婷 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 利用各細(xì)胞器在一定介質(zhì)中的利用各細(xì)胞器在一定介質(zhì)中的沉降速度的差沉降速度的差異異，可采取離心的方法，將細(xì)胞器分離出來。，可采取離心的方法，將細(xì)胞器分離出來。.離心技術(shù)離心技術(shù) 細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒細(xì)胞器沉降先后順序先后是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷離離 心心 方方 法法差速沉降離心法差速沉降離心法 速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)密度梯度區(qū)帶離心法帶離心法 生化教研室生化教研室 朱欣婷

4、朱欣婷差速沉降離心法差速沉降離心法(differential centrifugation) 采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)使沉降速度不同的顆粒，在不同的離心速度及不同離心時(shí)間下分批分離的方法。間下分批分離的方法。 加速加速 低速低速高速高速 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為差較大（一般為1010倍）的顆粒。倍）的顆粒。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分離效果差，不能一次得到純顆粒；分離效果差，不能一次得到純顆粒；

5、 壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高 時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀；時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀； 顆粒被擠壓，離心力過大、離心時(shí)間過長會(huì)使顆粒被擠壓，離心力過大、離心時(shí)間過長會(huì)使顆顆 粒變形、聚集而失活。粒變形、聚集而失活。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 每種純樣品成份在介質(zhì)溶液中的沉降速度可以表為：每種純樣品成份在介質(zhì)溶液中的沉降速度可以表為： V=d218(-s)2r。V V： 是某一時(shí)刻樣品的沉降速度（厘米是某一時(shí)刻樣品的沉降速度（厘米/ /秒）；秒）；d d： 樣品顆粒的直徑（厘米）；樣品顆粒的直徑（厘米）；：樣品顆粒的密度（克：樣品顆粒的

6、密度（克/ /厘米厘米3 3）；）；s s： 介質(zhì)溶液的密度（克介質(zhì)溶液的密度（克/ /厘米厘米3 3）；）；：介質(zhì)溶液的粘性系數(shù)（克：介質(zhì)溶液的粘性系數(shù)（克/ /厘米厘米秒）；秒）；：離心機(jī)重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（：離心機(jī)重軸的旋轉(zhuǎn)角速度（1/1/秒），秒），=2N=2N6060，N N：轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)/ /分；分； r r：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；：顆粒所在位置與旋轉(zhuǎn)軸心之間的距離，即離心半徑（厘米）；密度梯度離心法的理論依據(jù)密度梯度離心法的理論依據(jù) 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷待分樣品的沉浮行為如何確定？待分樣品的沉浮行為如何確定？ 當(dāng)當(dāng)S時(shí)時(shí) V0即樣品順離心力方

7、向沉降即樣品順離心力方向沉降S時(shí)時(shí) V0即樣品逆離心力方向上浮即樣品逆離心力方向上浮=S時(shí)時(shí) V=0即樣品停止沉降或上浮，即樣品停止沉降或上浮，“穩(wěn)定穩(wěn)定”在在這一位置這一位置用這個(gè)公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或用這個(gè)公式可以很好地解釋在速率區(qū)帶離心法或等密度區(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┑让芏葏^(qū)帶離心法中單一樣品的沉降（或上?。┬袨?。行為。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷速率區(qū)帶離心法速率區(qū)帶離心法 人為地加入不同密度的活性物質(zhì)，形成一個(gè)較為平緩的人為地加入不同密度的活性物質(zhì)，形成一個(gè)較為平緩的介質(zhì)梯度，將樣品加在介質(zhì)中進(jìn)行離心，在一定的離心力下介質(zhì)梯度，將樣品加在介質(zhì)中進(jìn)行

8、離心，在一定的離心力下根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，根據(jù)顆粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。形成不同區(qū)帶的分離方法。 此法用于分離具有一定沉此法用于分離具有一定沉降速度差的顆粒降速度差的顆粒（沉降速度差沉降速度差為為20% 或更少）或更少）或分子量相差或分子量相差3倍的蛋白質(zhì)倍的蛋白質(zhì)。適用于分離密適用于分離密度相似而大小有別的樣品。度相似而大小有別的樣品。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質(zhì)溶液中樣品在密度較高、密度梯度較為陡峭的介質(zhì)溶液中進(jìn)行離心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動(dòng)進(jìn)行離

9、心，具有不同密度的顆粒向上浮起，一直移動(dòng)到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，到與它們的密度相等的等密度點(diǎn)的特定梯度位置上，形成幾條不同的區(qū)帶，這就是形成幾條不同的區(qū)帶，這就是等密度區(qū)帶離心法。等密度區(qū)帶離心法。 等密度區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。此方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品。 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：a. 分離效果好，可一次獲得較純顆粒。分離效果好，可一次獲得較純顆粒。 b. 適應(yīng)范圍廣適應(yīng)范圍廣,能象差速離心法一樣分離具有沉降能象差速離心法一樣分離具有沉降 系數(shù)差的顆粒系數(shù)差的顆粒,又能分離有一定浮力密度差的

10、顆粒。又能分離有一定浮力密度差的顆粒。 c. 顆粒不會(huì)擠壓變形。顆粒不會(huì)擠壓變形。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：a.離心時(shí)間較長；離心時(shí)間較長； b.需要制備梯度；操作嚴(yán)格，不易掌握。需要制備梯度；操作嚴(yán)格，不易掌握。 密度梯度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法(density gradient centrifugation) 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷三、核酸的鑒定三、核酸的鑒定核核 酸酸 核苷酸核苷酸 磷磷 酸酸 堿堿 基基 戊戊 糖糖 定糖法（戊糖的差異）定糖法（戊糖的差異） 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（1 1）核糖核酸的鑒定）核糖核酸的鑒定濃HClHCCHCOCHOHC 3H2OHCCHCOC

11、HOHC+OHCH3HO D核糖核糖 糠醛糠醛 糠醛糠醛 3，5二羥基甲苯二羥基甲苯 綠色化合物綠色化合物 RNA水解水解 D核糖核糖HCCHCOHCCH3OOHCCH3地衣酚法地衣酚法: : CHOCCH2OHOHHC OHHC OHH 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（2）脫氧核糖核酸的鑒定）脫氧核糖核酸的鑒定 DNA水解水解 D脫氧核糖脫氧核糖CH2CHOHCHOHCH2OHCHO-H2O硫酸硫酸 CH2CH2CCH2OHCHOONH脫氧核糖脫氧核糖 羥基羥基酮基戊醛酮基戊醛藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物二苯胺法二苯胺法: : 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核）分離細(xì)胞

12、質(zhì)與細(xì)胞核（1）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核）分離細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核（2） 核酸的鑒定核酸的鑒定0.5g肝組織肝組織 少許石英砂少許石英砂研磨研磨加加5ml的的1.5%檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾檸檬酸溶液，研磨，雙層紗布過濾 肝勻漿，傾入離心管肝勻漿，傾入離心管離心：離心：3000r/min；10上層液上層液沉淀沉淀加入加入1ml 0.25mol/L 蔗糖檸檬酸溶液蔗糖檸檬酸溶液 核懸液核懸液沿壁緩鋪于沿壁緩鋪于9ml 0.88mol/L蔗糖檸檬酸液面上蔗糖檸檬酸液面上離心：離心：2000r/min；5上層液（棄去）上層液（棄去）沉淀沉淀核洗液核洗液5ml洗滌沉淀，離心：洗滌沉淀，離心：2000r/mi

13、n，5 （兩次）（兩次）上層液（棄去）上層液（棄去）沉沉 淀淀初步純化的細(xì)胞核初步純化的細(xì)胞核 5ml 0.02mol/L NaOH溶解細(xì)胞核溶解細(xì)胞核待測樣品待測樣品鑒定鑒定地衣酚法二苯胺法 實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 流流 程程 圖圖 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷 編編 號(hào)號(hào)12細(xì)胞質(zhì)（滴）細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核液（滴）核液（滴）-201mol/LKOH（滴）（滴）20202鑒定：取試管三支，編號(hào)，按下表操作鑒定：取試管三支，編號(hào)，按下表操作: 編號(hào)編號(hào)123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20-核液水解液（滴）核液水解液（滴）-20-5三氯醋酸（滴）三氯醋酸（滴）1010303,5一二羥基甲苯液

14、（滴）一二羥基甲苯液（滴）3030301.水解：取離心管二支，編號(hào)，按下表操作水解：取離心管二支，編號(hào)，按下表操作：（2） 核糖核酸的鑒定核糖核酸的鑒定混合各管混合各管沸水浴沸水浴(10)冷卻冷卻加入加入5%三氯三氯醋酸醋酸 (8ml)攪勻后離心攪勻后離心 2000r/min；5上清液上清液 立即混合各管立即混合各管沸水浴沸水浴(10)冷卻冷卻比較各管顏色比較各管顏色 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷2鑒定：取試管三支，編號(hào)，按下表操作鑒定：取試管三支，編號(hào)，按下表操作:1.水解：取離心管二支，編號(hào)，按下表操作水解：取離心管二支，編號(hào)，按下表操作：編號(hào)編號(hào)12細(xì)胞質(zhì)（滴）細(xì)胞質(zhì)（滴）20-核

15、液（滴）核液（滴）-201mol/L過氯酸過氯酸(滴）滴）2020 編號(hào)編號(hào)123細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）細(xì)胞質(zhì)水解液（滴）20-核水解液（滴）核水解液（滴）-20-1mol/L過氯酸（滴）過氯酸（滴）20二苯胺試劑（滴）二苯胺試劑（滴）202020（3）脫氧核糖核酸的鑒定）脫氧核糖核酸的鑒定混合各管混合各管冷卻冷卻離心離心 上清液上清液 立即混合各管立即混合各管冷卻冷卻比較各管顏色比較各管顏色 2000r/min;5 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷表表1.核糖核酸的鑒定核糖核酸的鑒定試管編號(hào)試管編號(hào)123現(xiàn)象現(xiàn)象試管編號(hào)試管編號(hào)123現(xiàn)象現(xiàn)象表表2.脫氧核糖核酸的鑒定脫氧核糖核酸的鑒定 生化教研室生化教研室 朱欣婷朱欣婷1規(guī)范操作，防止滴管、試劑的污染。規(guī)范操作，防止滴管、試劑的污染。2. 細(xì)核懸液的平鋪要輕柔；細(xì)核懸液的平鋪要輕柔；3. 濃酸的取用要小心；濃酸的取用要小心；4. 使用離心機(jī)注意平衡，轉(zhuǎn)速從低到高；使用離心機(jī)注意平衡，轉(zhuǎn)速從低到高；思思 考考1. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后若想繼續(xù)測定肝臟中本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后若想繼續(xù)測定肝臟中DNA、RNA的含的含 量，可用什么方法？量，可用什么方法？ 2. 我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了電泳法和層析法來分離蛋白質(zhì)，請問我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了電泳法和層析法來分離蛋白質(zhì)，請問 我們是否可以用這兩種方法分離我們是否可以用這兩種