論文正文百脈根

1、1前言土壤鹽堿化是人類(lèi)面臨的一個(gè)世界性問(wèn)題，開(kāi)發(fā)和有效利用鹽漬化和具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。提高植物的耐鹽是開(kāi)發(fā)和利用大量鹽漬化土地最有效的方法之一，也是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重大課題之一。采用傳統(tǒng)的方法選育耐鹽的植物品種固然簡(jiǎn)便可行，但進(jìn)展緩慢，局限性大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一大批與植物耐鹽有關(guān)的基因相繼得到克隆，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)有了重大突破，這為有效利用鹽堿地提高作物產(chǎn)量，治理鹽漬化土地提供了新的思路和方法。百脈根(Lotus corniculatus L)是豆科百脈根屬多年生牧草，又名牛角花、五葉草，蝶形花科多年生草本植物，產(chǎn)于歐亞溫暖地區(qū)，目前在世界各地廣泛種植，我國(guó)華東、華中、西南及西北均有分

2、布1。該牧草營(yíng)養(yǎng)豐富，耐寒、抗旱、耐澇、蟲(chóng)害少，花量大、自交結(jié)實(shí)、種子結(jié)實(shí)率高，較易得到穩(wěn)定遺傳的后代；其細(xì)胞再生性在豆科牧草中是最好的，遺傳轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，且轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)速度快。因此，百脈根是研究外源基因轉(zhuǎn)化、生物固氮機(jī)理、牧草品質(zhì)改良的豆科模式植物。盡管有許多優(yōu)點(diǎn)，但其大多數(shù)百脈根栽培品種苗期生長(zhǎng)緩慢、抗逆性差，這給產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)許多不便。因此，在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，利用生物技術(shù)對(duì)其加以遺傳改良，以培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的新品種，對(duì)改良和利用我國(guó)大面積的鹽堿地和荒漠化土地具有重要意義。液泡膜H+-PPase（V-H+-PPase）是分布于大多數(shù)陸生植物細(xì)胞中的一種獨(dú)特的酸化液泡的質(zhì)子泵2。H+

3、-PPase是植物液泡膜上普遍而豐富的成分,液泡膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶（H+-PPase）的主要功能有（1）具有質(zhì)子泵的功能。（2）能夠參與蔗糖的生物合成。（3）控制植物生長(zhǎng)素的運(yùn)輸。（4）在植物的抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用 3。孫艷香等人采用EST電子克隆和RACE技術(shù)從豆科模式植物百脈根中克隆到一個(gè)液泡膜H+-PPase基因的cDNA，命名為L(zhǎng)cVP1。該cDNA長(zhǎng)為2962bp，含2304bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼767個(gè)氨基酸，其推測(cè)的氨基酸序列與綠豆、擬南芥等I類(lèi)液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性在80以上，且有很高的功能區(qū)段保守性4 。不同的V-H+-PPase異構(gòu)體在不同組織和

4、器官中特異性表達(dá)，這樣可以產(chǎn)生大量的V-H+-PPase?？梢?jiàn)，植物不同器官組織V-H+-PPase含量受到有效調(diào)節(jié)，有利于提高適應(yīng)脅迫的能力。已有將LcVP1的同源基因AVP1的超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性 5，但至今還沒(méi)有將LcVP1基因轉(zhuǎn)入百脈根中改變植株V-H+-PPase活性以提高其耐鹽性的相關(guān)報(bào)道。本研究的目的就是將LcVP1基因轉(zhuǎn)入百脈根獲得的轉(zhuǎn)基因植株，其PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，對(duì)植株鹽脅迫處理后，測(cè)定其耐鹽性。2材料與方法2.1 材料以野生型和經(jīng)PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根為實(shí)驗(yàn)材料2.2 方法首先對(duì)崔紅敏師姐得到的4株轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根進(jìn)行了擴(kuò)繁，將百脈根切斷后放

5、入分化培養(yǎng)基中促進(jìn)其長(zhǎng)出叢生苗以達(dá)到擴(kuò)繁增加實(shí)驗(yàn)材料的目的。然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。鹽脅迫處理分別取野生型和轉(zhuǎn)基因型的1 cm莖尖轉(zhuǎn)入生根MS無(wú)激素培養(yǎng)基。培養(yǎng)基設(shè)三個(gè)鹽濃度分別為0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L，每個(gè)組合做3個(gè)重復(fù)。在鹽脅迫期間測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。2.2.2指標(biāo)測(cè)定2.2.2.1地上部分干重在每個(gè)處理下，分別取野生型植株和轉(zhuǎn)基因的地上部分，在80 下烘干48 h，稱(chēng)重。2.2.2.2 葉片相對(duì)含水量的測(cè)定葉片相對(duì)含水量（RWC）的測(cè)定采用飽和稱(chēng)重法，取百脈根葉片，用無(wú)菌水沖洗后，濾紙吸干表面水分，測(cè)定鮮重（FW），然后在4的無(wú)菌水中浸泡過(guò)夜，取出用濾紙吸干表面水

6、分，稱(chēng)出飽和重（TW）,最后轉(zhuǎn)到80烘干至衡重，稱(chēng)得干重（DW），葉片相對(duì)含水量=（FW-DW）/(TW-DW)100%2.2.2.3MDA含量的測(cè)定2.2.2.3.1 MDA含量測(cè)定的原理丙二醛(MDA)是常用的膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應(yīng)生成紅棕色的三甲川(3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮)，其最大吸收波長(zhǎng)在532 nm。但是測(cè)定植物組織中MDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450 nm，但532 nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中MDATBA

7、反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加TBA與蔗糖或MDA顯色反應(yīng)物在532 nm、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、MDA與TBA顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為每克干重100300gg1，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3的終濃度為0.5 molL-1。（1）直線回歸法 MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值為零。不同濃度的蔗糖(025 mmolL1)與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm的吸光度值與532 nm和600 nm處的吸光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBA顯色反應(yīng)后，測(cè)定上述三個(gè)波長(zhǎng)的吸光度值

8、，求其直線方程，可計(jì)算糖分在532 nm處的吸光度值。UV-120型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的直線方程為：Y532-0.001980.088D450（2）雙組分分光光度計(jì)法 據(jù)朗伯一比爾定律：DkCL，當(dāng)液層厚度為1 cm時(shí)，kDC，k稱(chēng)為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的吸光度值等于此混合液在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的吸光度值之和。已知蔗糖與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm和532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為85.40和7.40。MDA在450nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故該波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)為0，532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)為155，根據(jù)雙組分分光度計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：C

9、111.71D450 C26.45（D532D600）0.56D450 C1：可溶性糖的濃度(mmolL1)； C2：MDA的濃度(molL1)； D450、D532、D600分別代表450、532和600 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。2.2.2.3.2主要儀器設(shè)備 752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；離心機(jī)；電子天平（0.0001）；研缽；2.2.2.3.3實(shí)驗(yàn)試劑10三氯乙酸(TCA)；0.6硫代巴比妥酸：先加少量的氫氧化鈉(1 molL1)溶解，再用10的三氯乙酸定容；石英砂。2.2.2.3.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程取各種處理的葉片0.5 g放入研缽中，加入少許石英砂和2 ml 10%的三氯乙酸（TCA）研成勻漿，

10、將勻漿轉(zhuǎn)移到試管中，再用3 ml 10%的三氯乙酸分兩次沖洗研缽，合并勻漿，在提取液中加入5 ml 0.6%的硫代巴比妥酸溶液，搖勻，然后將試管放入沸水中煮沸10 min（自試管中出現(xiàn)小氣泡開(kāi)始記時(shí)），到時(shí)間后立即將試管放入冷水浴中，待試管冷卻后，過(guò)濾，量其體積，以0.3%的硫代巴比妥酸溶液為空白，用紫外分光光度計(jì)測(cè)450 nm，532 nm和600 nm處的吸光度值。2.2.2.3.5 結(jié)果計(jì)算按公式可直接求得植物樣品提取液中MDA的濃度。用雙組分分光光度法求得MDA的濃度，根據(jù)植物組織的重量計(jì)算測(cè)定樣品中MDA的含量：MDA含量(mol g-1)=MDA濃度(molL-1)提取液體積(ml

11、)植物組織鮮重(g) 3結(jié)果與分析3.1 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性高于野生植株由圖片（見(jiàn)附錄一）可知在沒(méi)有經(jīng)過(guò)NaCl脅迫生根培養(yǎng)基上的野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因型(LcVP1)植株在形態(tài)上沒(méi)有區(qū)別，但是在不同濃度的鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株綠色粗壯，而野生型植株葉黃細(xì)高。表明轉(zhuǎn)因植株教野生型植株具有較高的耐鹽性。3.2 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對(duì)含水量高于野生型植株葉片相對(duì)含水量的變化能反映出植株耐鹽性和抗旱性的強(qiáng)弱，變化較大的植株耐鹽性和抗旱性較弱，反之則較強(qiáng)。由圖1可以看出，在鹽脅迫期間，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對(duì)含水量都呈下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因植株葉片相對(duì)含水量的變化幅度小于野生型植株，

12、且葉片相對(duì)含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。例如，在100 mmolL NaCl下，野生植株的葉片相對(duì)含水量下降了53，而轉(zhuǎn)基因植株僅下降了45；這說(shuō)明，轉(zhuǎn)基因植株在受到鹽脅迫時(shí)具有較強(qiáng)的保水能力。圖1 NaCl脅迫下對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根葉片相對(duì)含水量3.3LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的地上部分干重下降趨勢(shì)高于野生型植株地上部分干重是顯示植物生長(zhǎng)狀況的指標(biāo)之一，由圖2 可知在鹽脅迫期間，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對(duì)含水量都呈下降趨勢(shì)，但轉(zhuǎn)基因植株葉片相對(duì)含水量的變化幅度小于野生型植株，且葉片相對(duì)含水量在高鹽濃度脅迫下高于野生型。在100 mmolL NaCl下，野生植株的地上部干重下降了40，而

13、轉(zhuǎn)基因植株的地上部干重僅下降了33。這表明轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫和干旱脅迫下的生長(zhǎng)狀況要明顯好于野生植株。圖2 NaCl脅迫對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根地上部干重的影響3.4 LcVP1轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜穩(wěn)定性高于野生型植株一般說(shuō)來(lái)，耐鹽植株和抗旱植株細(xì)胞膜系統(tǒng)在鹽脅迫和干旱脅迫后受損程度較小，且主要表現(xiàn)在MDA含量較低，細(xì)胞膜透性較小，反之，細(xì)胞膜受損程度嚴(yán)重。在受到鹽脅迫后，野生植株和轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量會(huì)有所增加，由圖3中數(shù)據(jù)可知，轉(zhuǎn)基因植株的增加幅度較野生植株平緩，且值低于野生型。在100 mmolL NaCl脅迫的處理下，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量增加2.3倍，而野生型植株的MDA含量增加了2

14、.5倍，表明轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞膜受損程度輕，其耐鹽性較野生型強(qiáng)。圖3 NaCl脅迫對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因型百脈根MDA含量的影響4 討論高鹽會(huì)對(duì)植物造成離子脅迫和滲透脅迫，嚴(yán)重影響了植物正常的生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)緩慢甚至死亡，然而許多植物在長(zhǎng)期鹽漬環(huán)境中會(huì)進(jìn)化出一系列機(jī)制對(duì)外界高鹽脅迫，在鹽漬生境中正常生長(zhǎng)。植物器官衰老或在逆境下遭受傷害時(shí)，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用。膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物比較復(fù)雜，包括一些醛類(lèi)、烴類(lèi)等。其產(chǎn)物之一丙二醛(MDA) 從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，可以與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)，改變這些大分子的構(gòu)型，或使之產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，從而喪失功能，還可使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。

15、因此，研究中常以MDA含量來(lái)反映植物膜脂過(guò)氧化的水平和對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度。 轉(zhuǎn)基因植株不僅要進(jìn)行分子檢測(cè)以確定其表型性狀，如耐鹽、抗旱、抗病、抗蟲(chóng)。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性有所提高；隨著鹽脅迫濃度的增加，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量的增加較野生植株的增加平緩，葉片相對(duì)含水量的下降較野生植株的下降平緩。轉(zhuǎn)基因植株的這些優(yōu)越性是因?yàn)镠+-PPase的過(guò)量表達(dá)，使液泡中積累Na+增加，維持了細(xì)胞離子平衡，特別是K+和Na+的平衡，并提高了液泡的滲透能力。目前有關(guān)液泡膜V-H+-PPase對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)有以下兩種看法：一是Na+對(duì)V-H+-PPase有抑制作用，NaCl脅迫下的V-H

16、+-PPase活性下降。Matsumoto等報(bào)道，經(jīng)200mmol/LNaCl處理的大麥根V-H+-PPase活性是對(duì)照的50，類(lèi)似現(xiàn)象也在400mmolL NaCl處理的冰葉日中花(Mesembryanthemum crystallinum)、100 mmolLNaCl處理的綠豆中觀察到6。外源Ca2+緩解NaCl對(duì)V-H+-PPase的抑制，5mmolL外源Ca2+使100mmolL NaCl脅迫的綠豆根V-H+-PPase活性完全恢復(fù)至對(duì)照的水平。另一觀點(diǎn)是NaCl誘導(dǎo)V-H+-PPase活性活性上升。Colombo等(1993)發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫增加了胡蘿卜懸浮細(xì)胞的V-H+-PPase

17、活性7。Ballesteros等發(fā)現(xiàn)NaCl脅迫下向日葵幼苗根中的H+-PPase活性比對(duì)照略有增加。50 mmolL NaCl處理的胡蘿卜細(xì)胞V-H+-PPase在10d內(nèi)較對(duì)照增加l倍，80 mmolL NaCl處理的歐亞槭（Acer Pseudoplatanus)細(xì)胞H+-PPase也成倍增加8。比較耐鹽性不同的兩個(gè)大麥品種(鑒4和科品7號(hào))V-H+-PPase對(duì)不同濃度NaCl(0、100、200 mmolL)的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)耐鹽的鑒4在兩種鹽濃度下，根系、葉片V-H+-PPase水解活性均上升，而不耐鹽的科品7號(hào)根系、葉片V-H+-PPase水解活性均下降，顯示了V-H+-PPase的基

18、因型差異。在100和400 mmolL NaCl脅迫下，鹽地堿蓬葉片中V-H+-PPase活性較對(duì)照增加9。李平華10的研究表明，用400 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，分離其葉片液泡膜微囊進(jìn)行Western blot分析發(fā)現(xiàn)鹽脅迫誘導(dǎo)了鹽地堿蓬V-H+-PPase蛋白表達(dá)并且其活性明顯增大，這與包華音11的研究結(jié)果一致。李圓圓121用100 mmolL NaCl處理鹽地堿蓬后，其幼葉和成熟葉中V-H+-PPase的水解活性均有所增加。此外，成熟葉中V-H+-ATPase的水解活性要高于幼葉，幼葉中V-H+-PPase水解活性要明顯高于成熟葉，這與V-H+-PPase在大多數(shù)的幼嫩組織中

19、是液泡膜上主要的質(zhì)子泵，而在成熟組織中V-H+-ATPase為液泡膜上主要的質(zhì)子泵的觀點(diǎn)一致。VeraEstrella等13用200mmolL NaCl處理鹽芥(The llungiella halophila)后，鹽芥葉片中H+-PPase水解活性是未做NaCl處理的1.3倍；Guo等14將鹽地堿蓬(Suaeda salsa)H+-PPase基因SsVP轉(zhuǎn)入擬南芥，400 mmolL NaCl處理能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植株葉中SsVP的表達(dá)。包愛(ài)科等3的研究表明高濃度的Na+通常會(huì)抑制V-H+-PPase的活性，而低濃度的Na+則會(huì)促進(jìn)V-H+-PPase的活性或提高其轉(zhuǎn)錄水平。Na+對(duì)V-H+-PP

20、ase活性的影響可能是由于Na+競(jìng)爭(zhēng)酶中K+結(jié)合位點(diǎn)而造成的15。因此V-H+-PPase可以作為衡量作物耐鹽性的一個(gè)指標(biāo)。由于植物的耐鹽性是由多基因控制的復(fù)雜性狀16，因此同時(shí)過(guò)量表達(dá)多個(gè)基因可能比單個(gè)基因更能賦予轉(zhuǎn)基因植物更強(qiáng)的耐鹽性17。李平華的研究表明，同時(shí)過(guò)量表達(dá)鹽地堿蓬Na+H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SsNHXl及擬南芥液泡膜焦磷酸酶基因AVPl的擬南芥植株比野生型擬南芥植株具有更強(qiáng)的抗鹽能力10。Zhao等17將鹽地堿蓬SsNHXl及擬南芥AVPl在水稻中同時(shí)過(guò)量表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株比單獨(dú)過(guò)量表達(dá)兩者之一的轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的耐鹽性； 本實(shí)驗(yàn)獲得的轉(zhuǎn)基因植株是單獨(dú)過(guò)表達(dá)LcVP1基因

21、，植株的抗鹽性的提高不是很顯著，在后續(xù)試驗(yàn)中可以同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)相關(guān)外源基因，可能會(huì)有賦予轉(zhuǎn)基因植物更強(qiáng)的抗鹽性。5.結(jié)論在鹽脅迫期間，轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對(duì)含水量、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、地上部分干重下降趨勢(shì)均高于野生型，綜上述表明轉(zhuǎn)LcVP1基因百脈根的抗鹽性有所提高。參考文獻(xiàn)1 孫艷香，楊紅梅，耿云紅，等根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究J.南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，39(2)：51-572 Maeshima M Vacuolar H+-pyrophosphataseJ.Biochim Biophys Acta. 20001465：37-513 包愛(ài)科，張金林，郭正剛，等液泡膜H+

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