細(xì)胞工程動物組織和細(xì)胞的培養(yǎng)介紹

1、第4節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)一 動物細(xì)胞培養(yǎng)類型(一)細(xì)胞原代培養(yǎng)1.取材分離· 取出組織塊放入小燒杯中，用尖嘴剪刀將組織塊剪碎成1mm3大小，加入Hanks液（平衡鹽水BSS） ，沖洗數(shù)次。·AdultEmbryoEgg取材分離DissectionEnzyme DigestionCell CultureFinely choppedPrimary ExplantsFurther dissectionif necessaryOrgan Culture2.組織消化：·是用酶法將剪碎的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞。·將剪碎的組織塊放人三角燒瓶中，加人3050倍體積的0.

2、25濃度胰蛋白酶； ·消化：37水浴內(nèi)消化3060分鐘。·過濾：如果大部分細(xì)胞已經(jīng)分散，終止消化，以不銹鋼篩過濾(100m）濾除未被消化的組織塊。·離心：8000rpm/min離心5分鐘，棄上清液,沉淀為細(xì)胞。·漂洗；Hanks液漂洗兩次，每次23分鐘，加人營養(yǎng)液 。3.細(xì)胞計(jì)數(shù)·細(xì)胞懸液制成后，需要計(jì)數(shù)懸液中細(xì)胞的濃度，通常以細(xì)胞個(gè)數(shù)ml表示。檢查方法如下：·1）在干凈的離心管中加人數(shù)滴細(xì)胞懸液，再加人6.4臺盼藍(lán)（trypan blue）1滴，混勻后靜置23分鐘；·2）將計(jì)數(shù)板（如圖）平放在顯微鏡臺上，在蓋片邊緣加人l2

3、滴染色的細(xì)胞懸液，使之完全充滿計(jì)數(shù)板與蓋片間的空間，勿留氣泡，勿使蓋片漂浮；·3）顯微鏡下記錄計(jì)數(shù)板四角四個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù)，原則是: 染藍(lán)的細(xì)胞不數(shù)（死細(xì)胞），無色的細(xì)胞計(jì)數(shù)（活細(xì)胞），一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。·計(jì)數(shù)時(shí)要注意：·如果細(xì)胞團(tuán)數(shù)超過10，說明消化過程進(jìn)行的不充分；·如果細(xì)胞數(shù)少于20-50個(gè)說明稀釋的不當(dāng).(二)傳代培養(yǎng)·當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展連片，占滿器皿表面。·這時(shí)需要對其分離重新培養(yǎng)，這一操作過程稱之為傳代。·有8090%或剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞，是傳代的理想時(shí)期。具體方法如下：1)吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊

4、培養(yǎng)液；2）加人胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底對細(xì)胞進(jìn)行消化；3）吸出消化液，加人Hanks液，洗去殘留的消化液。4）加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度；5）重新接種培養(yǎng)Tissue culture flasks· T-flasks· Petri dishes(三)微載體培養(yǎng)（microcarrier culture)·1967年，Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。微載體是直徑為60-250m的微珠。·最初使用的材料為二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖A50·后經(jīng)改進(jìn)，用帶不同基團(tuán)的葡聚糖（dextran

5、）交聯(lián)成幾種大分子，以利于細(xì)胞的貼壁及生長。·目前使用的dextran I、三種型號都屬于交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)的微載體，每種微載體所帶基團(tuán)各不相同。微載體培養(yǎng)細(xì)胞的具體步驟1）選擇合適的微載體類型先用少量三種微載體做細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，一定時(shí)間內(nèi)計(jì)算細(xì)胞貼壁數(shù)量，比較細(xì)胞用量、微載體用量，以此選出適當(dāng)?shù)奈⑤d體。（2）浸泡水化及消毒·在玻璃容器中加人適量的微載體，加入磷酸緩沖液（PBS）浸泡3小時(shí)以上，輕輕攪動。·攪動速度5070rpmmin為好。·高壓蒸汽滅菌，（3）接種·根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度，例如，人成纖維細(xì)胞的適宜接種濃度為10 cells微載體

6、；非洲綠猴腎細(xì)胞（vero）為5cells微載體。·接種要達(dá)到一定濃度，但過高也不利。培養(yǎng)中的攪拌轉(zhuǎn)速：·提供均相培養(yǎng)環(huán)境·防止微載體集聚·促進(jìn)汽液交換·30-120r/min（4）培養(yǎng)觀察· 顯微鏡直接觀察微載體上細(xì)胞生長· 將微載體上的細(xì)胞消化下來計(jì)數(shù)并計(jì)算其濃度:· 取1ml均勻的培養(yǎng)細(xì)胞樣品，待微載體沉淀后吸去上清液，加PBS液清洗。·加胰蛋白酶37消化15min，吸出消化液后加到培養(yǎng)液中，過濾分離微載體，離心棄上清夜，保留細(xì)胞沉淀；·加美藍(lán)染液2ml，血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞濃度。（5

7、）消化· 傳代培養(yǎng)或收獲細(xì)胞均需使細(xì)胞脫離微載體，通常采用酶消化法。消化步驟：· 停止攪動，待微載體沉淀后，去凈培養(yǎng)液，用含0.25EDTA的PBS（pH6.7），按50l00mlg微載體量清洗微載體，棄EDTA-PBs。· 加人胰蛋白酶一EDTA，37攪動消化15min· 加人含10%血清的培養(yǎng)液，終止消化作用。（6）分離細(xì)胞· 脫離微載體的細(xì)胞培養(yǎng)液放人容器，· 離心沉淀微載體（400rmin，2分鐘）收集細(xì)胞。· 還可用過濾方法，采用直徑100m孔徑的尼龍網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)等可將細(xì)胞與微載體分離開。（7）傳代培養(yǎng)·

8、 微載體上分離下來的細(xì)胞可進(jìn)一步做微載體傳代培養(yǎng)。· 可在細(xì)胞脫離微載體后，轉(zhuǎn)接細(xì)胞，加人一些新的微載體以增大培養(yǎng)體積。· 另一種放大培養(yǎng)方法：也可在微載體長滿細(xì)胞后直接加人微載體,更換培養(yǎng)基。(四)微囊化培養(yǎng)（microcapsule culture）· 微囊是用一種人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可以自由透過，而各種酶、輔酶、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質(zhì)包裹在其中不能逸出；· 細(xì)胞生長在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)。· 減少了攪拌對細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力· 由于環(huán)境的改善，細(xì)胞得到很好的生長，代謝產(chǎn)物濃度增加，純度提高

9、。· 制備動物細(xì)胞微囊所用的材料，主要是海藻酸（ALG）和多聚賴氨酸（PLL）.· 海藻酸和多聚賴氨酸分子量的大小及其溶液的濃度；細(xì)胞與海藻酸鈉混合的時(shí)間；溶液的pH，溫度等都會影響微囊膜直徑的大小.微囊制作1）分離好的細(xì)胞懸浮在1.01.2的海藻酸鈉液中，細(xì)胞終濃度達(dá)到1×107cellsml；2）細(xì)胞懸浮液經(jīng)微囊發(fā)生器制成微滴，將微滴加人1.3%CaCl2溶液后成凝膠球，10分鐘后，去除上清收集膠球;3）加人0.05的聚賴氨酸，微球膠體顆粒表面包裹一層膜.· 例1:應(yīng)用微囊化方法培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時(shí)，微囊膜孔徑大小控制截留8×104D以內(nèi)的分子

10、量，免疫球蛋白IgG（雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗）的分子量為1.5×105D。· 當(dāng)細(xì)胞生長穩(wěn)定，達(dá)到6×107 cellsml培養(yǎng)液時(shí)，抗體的產(chǎn)量可高達(dá)1.5mgml。· 例 2:將分離的胰島細(xì)胞培養(yǎng)13天后，按1.75×10 3cellsml濃度懸在1.5海藻酸鈉溶液中制成微囊，按4×103個(gè)微囊只老鼠，腹腔植人培養(yǎng)一段時(shí)間后，老鼠血糖下降,保持了一年。二、影響動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境因素1、培養(yǎng)溫度· 哺乳類細(xì)胞的最適培溫度37，雞細(xì)胞在3942，昆蟲類細(xì)胞2528，冷水魚細(xì)胞23，溫水魚26。·細(xì)胞對低溫的耐受力強(qiáng)

11、于高溫，有人做過實(shí)驗(yàn)：·放在45溫度下，1小時(shí)死亡；·放在4142下，1024小時(shí)細(xì)胞退化或死亡；·放在在2535時(shí)，細(xì)胞緩慢生長，·放在4下幾小時(shí)后再放人37下培養(yǎng)，細(xì)胞仍能生長。2、培養(yǎng)液的pH值·大多數(shù)動物細(xì)胞都適合在pH7.2pH7.4范圍內(nèi)生長.·原代培養(yǎng)細(xì)胞對pH值要求較嚴(yán)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞對pH值要求較寬。·細(xì)胞對偏酸環(huán)境的耐受性要強(qiáng)于偏堿環(huán)境。·通常是在培養(yǎng)液中加人一定量的磷酸緩沖液（PBS），保持培養(yǎng)液的pH值相對穩(wěn)定。·或用羥乙基呱嗪乙烷磺酸（HEPES）氫離子緩沖液。3、溶氧水平

12、3; 細(xì)胞生長離不開氧氣的供應(yīng)，培養(yǎng)初期細(xì)胞數(shù)量少，可以控制較低水平的溶氧量。· 隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，加大溶氧量。·對大多數(shù)動物細(xì)胞來說，培養(yǎng)過程中對氧的消耗速率范圍是：·4.5×10124.8×10 12 g（cellh）。4、培養(yǎng)液滲透壓·培養(yǎng)液的滲透壓是指用以阻止細(xì)胞水分子通過半透膜進(jìn)人培養(yǎng)液的壓力，其大小與其濃度成正比。· 原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般對滲透壓的波動較敏感，而細(xì)胞株和細(xì)胞系則耐受性較大。· 培養(yǎng)液需要一定的滲透壓。三 動物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)· （1）細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境· 氨離子：動物細(xì)胞體外培養(yǎng)中氨離子的積累是抑制細(xì)胞生長的主要因素之一。· 乳酸：它是細(xì)胞糖代謝的產(chǎn)物。高乳酸濃度必將抑制細(xì)胞生長。·二氧化碳：隨著細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模和培養(yǎng)密度的增大，二氧化碳積聚會對