免疫組化實驗步驟

1、石蠟切片免疫組化實驗步驟石蠟切片步驟按照曉峰整理的步驟進行（From 徐曉峰、朱老師的“石蠟切片”方案）：1）材料的準(zhǔn)備在本實驗室條件下推薦使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料。 FAA固定液（100ml），室溫保存 ：無水乙醇 50ml冰醋酸 5ml37%甲醛 10ml水 35ml第一天：組織固定用FAA固定，詳見“石蠟切片”protocol。第二天：脫水 Solution time number of changes50% ethanol 60 minutesone60% ethanol

2、60;60 minutesone*70% ethanol 60 minutesone以上所有步驟中每換好一步乙醇均置于4冰箱等待，并不時輕搖。* 組織可在70% ethanol 4可存放幾個月第三天：進一步脫水和浸蠟以下所有步驟在4進行并不時輕搖Solutiontimenumber of changes85% ethanol60 minutesone95% ethanol 60 minutesone以下所有步驟在室溫進行并不時輕搖Solutiontimenumber of changes100% ethanol  30 minutestwo100% ethanol 

3、0;60 minutestwo25%二甲苯, 75% ethanol 30 minutesone50%二甲苯, 50% ethanol 30 minutesone75%二甲苯, 25% ethanol+番紅 30 minutesone100%二甲苯60 minutestwo100% 二甲苯 + 1/4 volume Paraplast Plus (paraffin) chipsovernight(不要搖動) 準(zhǔn)備工作：60預(yù)熱plus蠟片（Paraplast Plus） 石蠟可反復(fù)融凝而去氣泡第四天：浸蠟 2將材料置于42直至蠟塊完全熔化。再加1/4體積

4、的蠟塊至完全熔化后移至60。幾個小時后換上新鮮熔好的蠟液，過夜。第五天：浸蠟 3換蠟兩次（Paraplast Plus）第六天：浸蠟 4換蠟兩次（Paraplast Plus）第七天：浸蠟 5換蠟兩次（Paraplast Plus）準(zhǔn)備工作：60預(yù)熱Regular蠟片（Paraplast Regular）第八天：包埋（包埋塊可長久保存） 第九天及之后：開始切片，切片應(yīng)包括自己的片子及正負(fù)對照等。事先打開烘片機至37度，在涂有多聚賴氨酸的玻片上加12ml的蒸餾水。切好的片子輕至于加水的玻片上。待所有片子準(zhǔn)備完之后蓋上蓋子，烘片過夜。用自來水及雙蒸水清洗免疫組化專用塑料，放在烘箱烘干待用。第二天：

5、開始脫蠟（From 徐曉峰、朱老師整理的“石蠟切片”protocol）Solutiontimenumber of changes100%二甲苯10 minutestwo100% ethanol1-2 minutestwo95% ethanol1-2 minutesone90% ethanol1-2 minutesone80% ethanol1-2 minutesone60 % ethanol1-2 minutesone30 % ethanol1-2 minutesonewater1-2 minutesonePBS(PH=7.4)5 minutesone PBS(PH=7.4)5 minutes

6、one（用新買來的免疫組化塑料小盒，每一步只需加入試劑220250毫升）抗原修復(fù)：在切片還浸入酒精時，可以事先將煮鍋清洗干凈，用蒸餾水洗12遍，最后加入0.01M檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.0)，煮沸(保持在95度左右)，將過完P(guān)BS的片子讓入煮沸的鍋中，煮片1015 min。然后將電磁爐關(guān)閉，自然冷卻鍋中切片（千萬不要把片子拿出來，放在緩沖液中一起自然冷卻至室溫?。?將片子浸入PBS（PH=7.4）5 min。 重復(fù)一遍。封閉：在抗原修復(fù)時可以事先配制封閉液，用PBS（PH=7.4）配制3% BSA的封閉液。將PBS中的切片放入封閉液中，室溫放置30分鐘1小時。雜一抗： 在封閉時可先剪好與切片

7、大小相當(dāng)?shù)姆饪谀?，并?zhǔn)備加有少量水的塑料大盒，用衛(wèi)生紙墊在塑料大盒中附帶的塑料板上。用封閉液稀釋一抗(GFP兔多抗以1:100稀釋，其它一抗需要另外嘗試)。將稀釋完的一抗加在片子上，每張片子保證不少于100ul，用封口膜封上，檢查是否有汽泡，輕輕趕走氣泡。將片子放在塑料大盒中，蓋上塑料蓋子，放入冰庫過夜。雜二抗： 事先配制好TBS(PH=7.4)緩沖液，用TBS（PH=7.4）緩沖液稀釋帶有堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗兔二抗，比例為1:200。將塑料大盒從冰庫中拿出，浸入TBS（PH=7.4）緩沖液中洗一抗，5min，重復(fù)3次，在洗一抗的過程中準(zhǔn)備封口膜。將片子上的殘余緩沖液倒去（但片子必須保持

8、濕潤?。┟繌埰蛹硬簧儆?00ul的二抗稀釋液，蓋上封口膜，放入塑料大盒中，室溫放置11.5小時。洗二抗并顯色 用TBS(PH=7.4)緩沖液洗二抗，5min,重復(fù)3次。同時在暗處配制顯色液（40ul溶液A+40ul溶液B+720ul水，可根據(jù)實際切片數(shù)量按比例配制顯色液），剪切封口膜。將片子至于暗處，倒去緩沖液，每張片子加不少于100ul的顯色液，輕輕蓋上封口膜，放于暗處進行顯色。每隔15分鐘左右看一下片子是否開始顯色(根據(jù)經(jīng)驗，加入顯色液30min1小時會開始顯色,但是需要根據(jù)不同蛋白表達(dá)強弱，把握顯色時間)。發(fā)現(xiàn)顯色之后需加蒸餾水終止反應(yīng)，再蓋上蓋玻片進行觀察并拍照。試劑：1. 0.01M PBS（PH=7.4）: 購買的小包裝粉末，溶于1L水中，待粉末溶解后調(diào)PH值至7.4。2. TBS: 2.4g Tris,