植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

1、植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展 摘要植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種科研手段，發(fā)展異常迅猛。從組織培養(yǎng)的原理、培養(yǎng)過程中遇到的問題以及前景和展望這 3方面綜述了我國近幾年植物組織培養(yǎng)的新研究。關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；存在問題；措施；發(fā)展20世紀(jì)后半葉，植物組織培養(yǎng)發(fā)展十分迅速，利用組織培養(yǎng)，不僅可以生產(chǎn)大量的優(yōu)良無 性系，并可獲得人類需要的多種代謝物質(zhì)；細(xì)胞融合可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性障礙，在植物新品種的培育和種性的改良中有著巨大的潛力；還可獲得單倍體、三倍體及其它多倍體、非整倍體；組織培養(yǎng)的植物細(xì)胞也成為在細(xì)胞水平上分析研究的理想材料 1。因此，植物組織培養(yǎng)廣泛應(yīng)用于植物科學(xué)的各個分支，如植物學(xué)、植

2、物生理學(xué)、遺傳 學(xué)、育種學(xué)、栽培學(xué)、胚胎學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)等，并廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等多 種行業(yè)，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，被認(rèn)為是一項(xiàng)很有潛力的高新技術(shù)。1組織培養(yǎng)的基本原理1.1 植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指在無菌條件下，將離體的植物器官（如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實(shí)、種子等 卜組織（如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等 卜細(xì)胞（如體細(xì)胞、生殖細(xì) 胞等）、胚胎（如成熟和未成熟的胚卜原生質(zhì)體培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽等，或長成完整的植株的技術(shù)2。1.2 植物組織培養(yǎng)的依據(jù) 植物組織培養(yǎng)的依據(jù)是植物細(xì)胞“全能性”及植物的“再

3、生作用” 。1902年，德國著名植物 學(xué)家GHaberlanclt根據(jù)細(xì)胞學(xué)理論3,大膽地提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割， 直到單個細(xì)胞，即植物體細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植株的潛力的觀點(diǎn)。1943年，美國人 White在煙草愈傷組織培養(yǎng)中，偶然發(fā)現(xiàn)形成一個芽，證實(shí)了 GHaberlanclt的論點(diǎn)4。在許多科學(xué)家的努力下，植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，其理 論和方法趨于完善和成熟，并廣泛應(yīng)用產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。 1.3培養(yǎng)基的選擇組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有 MT、MS SH、White等5。由于不同植物所需要的生長條件有所 不同，會對培養(yǎng)基做一些不同的

4、處理，一般采用較多的是MS。組織培養(yǎng)采用固體培養(yǎng)基的較多，但只有在植物周圍的營養(yǎng)物和激素被吸收，如果其他殘留的培養(yǎng)基也能被利用，對工廠化生產(chǎn)的成本減少方面有很大的幫助。董雁等6利用回收轉(zhuǎn)換后廢棄的繼代培養(yǎng)基，加入原繼代培養(yǎng)基 30 %濃度母液的培養(yǎng)基，培養(yǎng)效果與原繼代培養(yǎng)基的基本相同，說明繼代 培養(yǎng)基再利用是可行的，這為規(guī)模化組培育苗開辟了新的途徑。杜勤7等在無外源激素條件下，研究液體和固體培養(yǎng)基對黃瓜子葉培養(yǎng)器官分化的影響，結(jié)果用液體培養(yǎng)基直接誘導(dǎo)花芽率更高，分化高峰期出現(xiàn)的時(shí)間也更早，說明液體培養(yǎng)基對外植體的生長更有利，只是固體培養(yǎng)基更易操作而被較廣泛應(yīng)用。2植物組織培養(yǎng)過程中存在的問題2

5、.1 污染問題組織培養(yǎng)過程中的污染包括內(nèi)因污染和外因污染。內(nèi)因污染指由于外植體的表面或者內(nèi)部帶菌而引起的污染；外因污染則是主要由環(huán)境污染和操作不當(dāng)引起，是指在接種或培養(yǎng)過程中病菌入侵，例如培養(yǎng)基、接種工具和接種室消毒不嚴(yán)格以及操作不規(guī)范等8。針對植物組織培養(yǎng)中污染產(chǎn)生的原因，應(yīng)從以下2個方而著手來控制污染。一是控制外植體自身帶菌，外植體的表而帶菌可以經(jīng)過一系列的殺菌處理來減少；而外植體的內(nèi)部帶菌是不容易清除的，但也可以通過對外植體的預(yù)培養(yǎng)來加以控制；一是降低環(huán)境污染和操作污染， 這類污染可通過規(guī)范操作程序加以控制9。2.2 褐化問題2.2.1 .發(fā)生形式細(xì)胞受脅迫條件或其他不利條件影響而死亡或

6、細(xì)胞發(fā)生自然死亡；材料傷口分泌的酚類物質(zhì)，在多酚氧化酶作用下氧化為醍類物質(zhì)形成的。2.2.2 影響因素外植體、培養(yǎng)基、 pH值、培養(yǎng)條件、其他。2.2.3 解決途徑2.2.3.1 選取適宜的外植體一般木本植物的酚類化合物較草本高，組培時(shí)木本植物更易褐化；外植體的老化程度越高， 其木質(zhì)素的含量也越高，也越易褐化，成齡材料一般比幼齡材料褐化嚴(yán)重10,切口越大，酚類物質(zhì)的被氧化面積也越大，褐化程度就會越嚴(yán)重；由于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚 氧化酶的活性在不同的生長季節(jié)不同，一般在生長季節(jié)含較多的酚類化合物，在取材部位上存在幼嫩莖尖較其他部位褐化程度嚴(yán)重。2.2.3.2 選取適宜的培養(yǎng)基(1)利用抗

7、氧化劑、吸附劑?？寡趸瘎┠軌蜃柚苟喾友趸飳Ψ宇愇镔|(zhì)的氧化作用，減少褐 變。目前常用的抗氧化劑有硫代硫酸鈉(Na2s2O3植酸(PA卜抗壞血酸(Vc)、過氧化氫、半胱氨酸等，吸收劑有活性炭(AC開口 PVP(聚已烯口比喀烷酮)11?？寡趸瘎┮⒁夥执问褂茫瑧?yīng) 注意有些抗氧化劑會對培養(yǎng)物產(chǎn)生毒害作用，要避免長期在含這些抗氧化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如果先期褐變得到了控制，就應(yīng)該從培養(yǎng)基中除去抗氧化劑。楊薇紅等在亞洲百合接種前用50 mg/L Vc浸泡外植體2 h及在之后的繼代培養(yǎng)中加入150 mg/L PVP以抑制組培苗褐變現(xiàn)象的發(fā)生12。張紅對庫拉索蘆薈組培中的褐變現(xiàn)象，培養(yǎng)基中加入活性炭 500.

8、0 mg/L,環(huán)境溫度控制在25 C有利于減輕褐變13。(2)使用金屬螯合劑(EDTA)由于多酚氧化酶是一種含銅的蛋白質(zhì)，其氧化活性依賴于銅的氧化還原作用，而金屬螯合劑可以把銅離子從酶中螯合出來，形成穩(wěn)定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性。(3)瓊脂量的減少、較低的pH值利于減少褐變。(4)培養(yǎng)基中適宜的細(xì)胞分裂素濃度可以減輕或抑制褐變。這在很多植物的組培研究中都得 到證實(shí)，張紅在庫拉索蘆薈組培中的褐變現(xiàn)象及防止試驗(yàn)中也表明，適宜的6-BA濃度(2.0mg/L)對庫拉索蘆薈的褐變現(xiàn)象有較好的抑制作用14。2.2.3.3 選取適宜的培養(yǎng)條件試驗(yàn)證明適度的低溫、初培暗光或弱光培養(yǎng)可抑制酚類的氧化。陳紅

9、等在試驗(yàn)中，低溫預(yù)處理對刺梨花藥愈傷組織誘導(dǎo)有顯著的影響，以低溫處理3d,花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，褐化率最低15。趙伶俐等以蝴蝶蘭R4品種葉片為外植體，研究不同時(shí)間的黑暗預(yù)處理對褐化率、多酚氧化酶(PPO活性和總酚含量的影響。結(jié)果表明，黑暗預(yù)處理能減輕褐化16。2.2.3.4 其他方法熱擊處理，采用 45 C以上的短時(shí)間高溫處理能夠使多酚氧化酶失去活性17,從而達(dá)到抗褐變的目的，另外適度縮短繼代周期，可以從一定程度上使褐變減輕。2.3 玻璃化現(xiàn)象2.3.1 作用機(jī)理 內(nèi)源激素失調(diào)，能量代謝受阻，蛋白質(zhì)的正常合成受抑，使分化難以順利啟動，細(xì)胞發(fā)育異常而致。2.3.2 發(fā)生因素外植體材料差異、環(huán)境

10、濕度、碳源、無機(jī)鹽、外源激素、溫度、光照、培養(yǎng)基pH值及其添 加物等。2.3.3 克服方法2.3.3.1 適宜的外植體劉非燕等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，重瓣石竹頂芽產(chǎn)生的試管苗玻璃化百分率最低，基部莖段次之，中部莖段最高18。分析這種差異性主要是由頂芽到莖基在內(nèi)源激素含量和比例上的差異而致。2.3.3.2 培養(yǎng)基的硬度調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，提高瓊脂濃度，玻璃化的比例明顯下降。2.3.3.3 培養(yǎng)基成分提高培養(yǎng)基的碳氮比，降低NH+4濃度或及時(shí)轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基，在其中加入適量的根本甘、活性 炭或聚乙烯醇和青霉素G鉀等添加物。2.3.3.4 合適的培養(yǎng)環(huán)境適當(dāng)提高光照強(qiáng)度，保持適宜溫度25 c (19.530 C)利

11、于控制玻璃化19,降低濕度(瓶內(nèi)的空氣濕度和培養(yǎng)基的含水量)，改善氧氣供應(yīng)狀況利于減少玻璃化苗的出現(xiàn)18。2.3.3.5 適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素濃度和細(xì)胞分裂素與生長素比例許多報(bào)道指出，培養(yǎng)基中外源細(xì)胞分裂素供應(yīng)過多容易導(dǎo)致組培苗玻璃化。如在沾化冬棗的快繁中，培養(yǎng)基中6-BA的濃度為35 mg/L時(shí)，能顯著促進(jìn)外植體發(fā)生褐化；在重瓣絲石 竹的組培中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中高濃度的細(xì)胞分裂素，尤其在 6-BA為5.0 mg/L時(shí)，是影響玻璃 苗發(fā)生的主要原因20。2.3.3.6 熱擊處理高于40 C的溫度對外植體熱擊處理可消除玻璃化。2.4 黃化現(xiàn)象2.4.1 原因培養(yǎng)基中Fe的含量不足；各礦質(zhì)營養(yǎng)不均衡；培

12、養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶內(nèi)乙烯含量升高；激素配比不當(dāng)；糖用量不足或長時(shí)間不轉(zhuǎn)移導(dǎo)致糖耗盡；pH值變化過大；培養(yǎng)溫度不適；光照不足等都會造成黃化現(xiàn)象的出現(xiàn) 21。2.4.2 解決方法(1)配制母液和培養(yǎng)基的制作過程中，要檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確，還要認(rèn)真細(xì)致地核對每項(xiàng)稱量的每一個環(huán)節(jié)。(2)配制培養(yǎng)基時(shí)切記不要忘記加糖。(3)及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物。(4)使用透氣的封口膜以改善瓶內(nèi)通氣狀況。(5)適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、激素配比和無機(jī)鹽濃度。(6)控制培養(yǎng)室內(nèi)的溫度；適當(dāng)增加光照。(7)在培養(yǎng)基中添加抗生素類物質(zhì)如青霉素、鏈霉素、頭抱霉素等，有時(shí)也會出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象，應(yīng)適當(dāng)減少用量或停止使用。3植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用植物組織

13、培養(yǎng)技術(shù)不僅是植物體細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，而且對理論研究和植物基因工程以及農(nóng)作物品種改良等都具有重大意義。3.1 在植物育種上的應(yīng)用3.1.1 進(jìn)行單倍體育種取未成熟的花藥或花粉粒培養(yǎng)，很容易獲得單倍的胚狀體，然后用秋水仙堿等加倍劑處理 胚狀體，使染色體加倍，形成正常的二倍體。 與一般二倍體不同的是，這樣獲得的二倍體基因型是純合的。在自然界，自花授粉植物是純系，而異花授粉植物基因型是雜合的。要獲得異花授粉植物的純系，至少需要自交10代以上。對于自粉授粉植物，通過雜交方式導(dǎo)入新的基因后，利用花藥或花粉單倍體培養(yǎng)，然后加倍，獲得純系，將大大縮短育種年限22。同樣，對于異花授粉植物，利用花藥和花粉培養(yǎng)可

14、縮短雜交后代的純合時(shí)間，加快雜交育種進(jìn)度23。然而，花藥和花粉單倍體培養(yǎng)主要在自花授粉植物中獲得成功，對于異花授粉植 物還比較困難。花藥和花粉單倍體培養(yǎng)的技術(shù)完善和突破，將會推動雜交育種的發(fā)展。3.1.2 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性carlsno等在1972年獲得第一株煙草體細(xì)胞雜種植株以來，細(xì)胞融合技術(shù)在不斷改善和發(fā)展，獲得體細(xì)胞雜種植株的植物種類在不斷增加24。細(xì)胞融合可打破種屬間的界限，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性障礙，在植物新品種的培育和種性的改良中有著巨大的潛力。通過原生質(zhì)體融合，不僅可克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，而且能創(chuàng)造新品種和從中選擇到優(yōu)良品種；還可轉(zhuǎn)移植物雜交育種上有重要價(jià)值的細(xì)胞質(zhì)雄性不育基

15、因，迅速選育出期望的雄性不育系25。在經(jīng)濟(jì)林木和果樹上，柑桔原生質(zhì)體融合是最早而且是成功事例最多的種類。 3.1.3獲得抗病品種 無論是愈傷組織培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界因素(如射線、化學(xué)物質(zhì)等)的影響而產(chǎn)生誘變26。從中可以篩選出對人們有用的突變體， 從而育成新品種。例如植物抗病蟲性、抗寒、耐鹽、抗除草劑毒性、生理生化變異株等的誘 發(fā)，為進(jìn)一步篩選和選育提供了豐富的變異材料27。1988年美國ostyr等28利用細(xì)胞變異成功篩選出楊樹抗病新無性系。目前，用這種方法已篩選到抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋 白、矮稈高產(chǎn)的突變體，有些已用于生產(chǎn)。3.2 快繁和植

16、株再生體系的建立植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)具有周期短，繁殖快，節(jié)省空間的優(yōu)點(diǎn)。用無性系快速繁殖比種子繁殖節(jié)省時(shí)間。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前己有 92個屬、近300種樹種通過器官或組織培養(yǎng)技術(shù)獲 得了完整的試管植株，如楊屬、薔薇科、蕓香科及豆科多個屬中的許多種，還有銀杏、棗、 茶、荔枝、杜鵑等，其中按樹、楊樹、輻射松等重要樹種已大面積應(yīng)用于生產(chǎn)，澳大利亞、 新西蘭己分別實(shí)現(xiàn)用按樹和輻射松試管苗造林29。大量研究表明，從愈傷組織表面或內(nèi)部形成芽和根，其分化取決于培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的比例，高濃度的細(xì)胞分裂素有利于芽的分化，而高水平的生長素則誘導(dǎo)根的形成。胚狀體發(fā)生是木本植物植株再生的另一條重要途徑。據(jù)不

17、完全統(tǒng)計(jì)，目前高等植物已有50科名1 180多種植物可通過胚狀體發(fā)生途徑再生植株30。4植物組織培養(yǎng)的前景和展望組織培養(yǎng)技術(shù)已為人們廣泛的應(yīng)用在各個領(lǐng)域，它為許多學(xué)科研究植物生長發(fā)育、抗性生理、激素及器官發(fā)生與胚胎發(fā)生等提供了許多良好試材和有效途徑。但組培育苗存在成本高、技術(shù)復(fù)雜等問題，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，組培育苗將在未來植物繁殖中占有重要地位。其發(fā)展趨勢如下31:(1 )組培技術(shù)育苗植物種類不斷增加。如組培技術(shù)育苗種類有果樹、蔬菜、草坪草、花卉、香料植物、藥用植物、茶葉、農(nóng)作物等，既有草本又有木本。(2 )組培技術(shù)程序簡化，組培成本降低。例如 ：用全自然光代替人工光照的組培育苗技術(shù)， 使

18、組培育苗的成本大幅度降低；新藥品、新方法的運(yùn)用將使傳統(tǒng)的組培技術(shù)得以改進(jìn)，使組培育苗技術(shù)更經(jīng)濟(jì)、更實(shí)用。(3 )組培技術(shù)不斷提高。由最初的莖尖快繁到花藥培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì) 胞雜交等。(4)組培技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。由植物的簡單繁育到突變體選育、種植資源保存等。(5 )組培技術(shù)逐漸向自動化方向發(fā)展。隨著現(xiàn)代化溫室在我國的應(yīng)用及環(huán)境控制水平的提 高，組培育苗將與現(xiàn)代化溫室、電腦自控調(diào)節(jié)等手段相結(jié)合，使其效率更高。參考文獻(xiàn)：1王魯彤.淺談植物組織培養(yǎng)技術(shù)存在的問題與應(yīng)用J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, (8): 102 -1042王文靜，袁道強(qiáng)，高松潔.植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀J.河南師

19、范大學(xué)學(xué)報(bào),2000,(3):137-1393盛玉婷.植物組織培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展J.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008, (9): 14-154董雁，趙繼梅，別婉麗.繼代培養(yǎng)基再利用研究J.遼寧林業(yè)科技，1998, (4) : 131-1325杜勤，竺莉紅，梁海曼.無外源激素條件下液體和固體培養(yǎng)基對黃瓜子葉培養(yǎng)器官分化不同影響J.生物技術(shù)，1996, 6(1): 172-1916王魯彤.淺談植物組織培養(yǎng)技術(shù)存在的問題與應(yīng)用J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, (8): 102-1047楊麗琴，李瑞.植物組織培養(yǎng)白三大難題 J.北方園藝，2008, (4) : 104-1078楊薇紅，張延龍，童斌，等 .亞洲百合花

20、器官的組培快繁技術(shù)研究J.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2004, 20(5): 193-1959張紅.庫拉索蘆薈組培中的褐變現(xiàn)象及防止J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008, 36 (6): 57-5810陳紅，張綠萍.不同處理對刺梨花藥愈傷組織誘導(dǎo)及褐變的影響J.北方園藝，2008,(7): 215-21711趙伶俐，葛紅，范崇輝，等.不同光照強(qiáng)度對蝴蝶蘭組培中外植體褐化的影響J.北方園藝，2006, (4): 160-16112劉非燕，郭達(dá)初.重瓣絲石竹試管苗玻璃化發(fā)生原因初探J.杭州大學(xué)學(xué)報(bào)，1996, 23(4): 382-38713張孝霖，劉雪紅，段代祥，等 .建立沾化冬棗離體再生體系的防褐化研究J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007, 35 (15): 44-4514潘娟，李先源，李名楊.植物組織培養(yǎng)過程中常見問題及解決方法J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, 37 (6): 92-9415馬慧，張立軍，阮燕煒，崔振海 .植物組織培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢J.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007, 35 (6): 2-416達(dá)克東，李雅志，束懷瑞.蘋果葉片愈傷組織植株再生研究J.核農(nóng)學(xué)報(bào)，1995, 9 (3):139-14317潘增光，鄧秀新，章文才等.蘋果原生質(zhì)體研究進(jìn)展一文獻(xiàn)綜述J.園藝學(xué)報(bào)，1997,2